生物化学和分子生物学七年制实验一.ppt

生物化学和分子生物学实验,1 必须穿白大褂； 2 书包放在实验台的上层架子上； 3 实验报告在实验课后24小时内由组长统一上交； 值日生注意事项强调： 1 清洁实验台上层架子； 2 用湿抹布擦黑板； 3 清洁比色皿； 4 将所有移液枪调到最大量程。,第一节 分光光度法(Spectrophotometry),定义： 根据物质对光的吸收特性和吸收强度，对物质进行定性和定量的分析方法。,溶液的颜色实质是它所吸收的色光的互补色。如：日光照射KMnO4，其中绿光被吸收，故溶液呈紫色。CuSO4呈蓝色是由于溶液吸收了黄光。,溶液越浓，光选择吸收越多，颜色越深。,比较溶液颜色的深浅，实质比较溶液对光的吸收程度。,溶液的颜色,http:/zh.wikipedia.org/wiki/%E9%A2%9C%E8%89%B2,互补色,互补色光 如：黄光和蓝光； 红光和绿光。,光,光是一种电磁波。自然光是由波长（）不同的电磁波组成的混合光。,可见光,可见光， 在400760nm范围。,光的吸收定律,A=KLC,A=KLC,C：物质的浓度， g/L molL L：光程，cm， K：吸光系数 摩尔消光系数：当溶液浓度为lmolL，光程为1cm时所测得的一定波长下的吸光度。 百分比吸光系数K：当溶液浓度为l00gL，光程为1cm时所测得的一定波长下的吸光度。 吸光系数只与物质的性质和入射光的波长有关。,波长的选择,波长的选择一般是选择待测物质最大吸收峰的波长(max),1应使被测溶液有适当的光密度，适当的光密度为0.10.7，而以0.20.6最理想。 2应使干扰影响降低至最低限度。 3应使标准曲线在尽可能大的范围内接近直线。,待测溶液浓度的计算,1.利用标准管法计算待测溶液的浓度 2.利用标准曲线进行换算 3.利用LambertBeer定律 计算 A=KLC C=A/KL,利用标准管法计算待测溶液的浓度,实验步骤,1 2 3 4 5 6 7,标 准 管 测定管 空白管,试剂,蛋白质标准液（ml） 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0,蛋白质测定液（ml） 1.0,0.9%NaCL （ml） 0.8 0.6 0.4 0.2 1.0,双缩脲试剂 （ml） 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0,蛋白质标准液浓度：Cs=10mg/ml,实验记录,双缩脲法测定蛋白质浓度 日期 室温,公式计算法求蛋白质浓度,=74.3mg/ml,1标准曲线的作用 (1) 从浓度一 光密度直线的直线特性，可以判断所采用方法的呈色反应是否符合LambenBeer氏定律。 (2)作多次平行测定绘制标准曲线，可判断在整个测定过程中操作，仪器等误差的大小，从而确定该测定方法的可靠性。 (3)从绘制标准曲线的斜率可以比较各种方法的灵敏度。 (4)当进行大批样品分析时，可省略多次计算，从光密度值直接查阅标准曲线而求得被测物质的浓度。,2标准曲线的作法,(1)标准液浓度的选择：标准液浓度选择一般应能包括待测样品的可能变异最低与最高值，一般可选择5种浓度。浓度差距最好是成倍增加或等级增加。 (2)标准液的测定：在比色时，读取光密度至少读23次，求其平均值，以减少仪器不稳定而产生的误差。,实验步骤,1 2 3 4 5 6 7,标 准 管 测定管 空白管,试剂,蛋白质标准液（ml） 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0,蛋白质测定液（ml） 1.0,0.9%NaCL （ml） 0.8 0.6 0.4 0.2 1.0,双缩尿试剂 （ml） 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0,3.标准曲线图的绘制：,用普通方格纸作图。以横轴为浓度，纵轴为光密度。 若各点不在一直线，则可通过原点，尽可能使直线通过更多点，使不在直线上的点尽量均匀地分布在直线的两边。 标准曲线绘制完毕以后，应在座标纸上注明实验项目的名称，所使用比色计的型号和仪器编号、滤光片号码或单色光波长以及绘制的日期、室温。 绘制好的标准曲线只能供以后在相同条件下操作测定相同物质时使用。,绘制标准曲线,A,0.101 0.202 0.303 0.404 0.505 0.375 0.000,C(mg/ml) 20 40 60 80 100 ? 0,C mg/ml,A,20,60,40,80,100,0.1,0.2,0.3,0.4,0.5,.,.,.,.,.,项目、日期、室温 仪器型号、编号、波长,第二节 蛋白质定量分析,蛋白质定量分析即蛋白质溶液的浓度测定； 现实应用：1. 临床检测血清蛋白浓度测定；2. 科学研究纯化蛋白的浓度测定；,主要方法,根据蛋白质元素组成凯氏定氮法； 根据蛋白质组成特点建立的比色法双缩脲法，lowry改良法，考马斯亮蓝染色法，BCA法； 根据蛋白质的吸收特性建立的紫外分光光度法；,双缩脲法,一、实验原理双缩脲反应,OH-,蓝色,紫红色,蛋白质的双缩脲反应,Cu2+,OH-,实验步骤,1 2 3 4 5 6 7,标 准 管 测定管 空白管,试剂,蛋白质标准液（ml） 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0,蛋白质测定液（ml） 1.0,0.9%NaCL （ml） 0.8 0.6 0.4 0.2 1.0,双缩尿试剂 （ml） 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0,标准曲线,根据Lambert-Beer定律， A与C成正比,配制一系列标准液 C1、C2、C3， 在max下，测相应的A1、A2、A3。,C / (mol L-1),Ax,Cx,蛋白质的紫外吸收,Tyr,Trp,蛋白质分子中含有共轭双键的芳香族氨基酸。它们具有吸收紫外光的性质。 其最高吸收峰在280nm波长处，且在此波长内吸收峰的光密度值与其浓度成正比。 要有待测的蛋白质的标准品作比较，才能进行准确定量。,实验步骤,样品 测定管 空白管,待测血清样本 0.4 生理盐水 3.6 4.0,BCA测定蛋白质浓度,在碱性条件下蛋白质与二价铜离子Cu2+络合，并将其还原成一价铜离子Cu1+。 Cu1+和BCA试剂反应, 形成稳定的紫蓝色复合物。 反应所生成的复合物，在562 nm处有强烈的光吸收，且吸光值和蛋白质浓度在广泛范围内有良好的线性关系，可用于蛋白质浓度的测定。,待测样品：将双缩脲待测样本稀释10倍，即取双缩脲待测样本100ul+生理盐水900ul稀释成1000ul待测样本。,双缩脲法：540nm，玻璃比色杯，vis-7220 紫外法：260，280nm，石英比色杯，uv-9200或者uv-9600或者uv-2000。调节不同波长时需要再次调零 BCA法562nm，用0.5cm的比色杯，同时应特别注意，BCA法的标准品与双缩脲和紫外法的不同 双缩脲与BCA需做标准曲线。紫外法不需做标准曲线。,实验报告,一 原始记录 记录实验所获得的原始数据。,标准 测定 空白,A,0.00,原始记录需实验课结束教师签字,双缩尿/BCA法测定蛋白质浓度,1 2 3 4 5 6 7,A,空白,A260 A280,紫外法测定蛋白质浓度,A260/A280=,测定,实验报告,将原始记录置于第一页，装订一同上交。 实验原理（清晰） 实验步骤（简略但清晰） 数据处理（数据带入的过程，若为定性实验则为观察到的现象） 实验结果 实验讨论（讨论实验成败的原因，实验可改良的地方等）,双缩脲测定蛋白质浓度计算,BCA测定蛋白质浓度,0.375,0.404,Cx,=,1.5mg/ml80l,100 l,1,100,紫外分光光度法测定蛋白质浓度,Cx,=,A 280,KL,稀释倍数,K= 0.63L /cm.g,L=1cm,稀释倍数=100,实验一 蛋白质定量分析技术,双缩脲法 紫外分光光度法 BCA（二喹啉甲酸）法 Lowry法(Lowry改良法) 考马斯(Comessie)亮兰结合法 凯氏定氮法,一、双缩脲法测定蛋白质含量,双缩脲(NH2CONHCONH2)在碱性溶液中与硫酸铜反应生成紫红色化合物，称为双缩脲反应。 蛋白质分子中含有许多肽键(-CONH-)在碱性溶液中也能与Cu2+反应产生紫红色化合物。在一定范围内，其颜色的深浅与蛋白质浓度成正比。,【原理】,优点： 双缩脲法是测定蛋白质浓度的常用方法之一； 测定浓度范围：2-10mg/ml； 操作简便、迅速； 受蛋白质种类性质的影响较小，常用于蛋白质分离纯化的早期步骤。 缺点： 灵敏度较差； 而且特异性不高，除-CONH-有此反应外，-CONH2、-CH2NH2、-CS-NH2等基团也有此反应。,【操作】,【结果】,1、在座标纸上以光密度为纵座标，以蛋白质浓度为横座标绘制标准曲线。 2、从标准曲线中查出待测血清样本的蛋白质浓度(g/L)，并求出人血清样本的蛋白质浓度。 3、从标准管中选择一管与测定管光密度相接近者，求出人血清样本的蛋白质浓度(g/L)。,二、紫外分光光度法测定蛋白质浓度,【原理】,蛋白质分子中含有共轭双键的酪氨酸、色氨酸等芳香族氨基酸。它们具有吸收紫外光的性质，其吸收高峰在280nm波长处，且在此波长内吸收峰的光密度值与其浓度成正比关系。 测定范围：1mg/ml,优点：操作简便迅速，且不消耗样品(可以回收)，多用于纯化蛋白质的微量测定。 缺点：当待测的蛋白质与标准蛋白质中的酪氨酸和色氨酸含量差异较大时，可产生一定误差。 混有核酸时必须分别测定280nm和260nm两处的OD值，再按公式推算蛋白质含量。,将样品按表稀释，在280nm和260nm两处波长分别测得吸光度值。 计算公式： 1、A280/A2601.5时，用Lowry-Kalokar公式： 样本蛋白质含量(mg/ml)=1.45A280 0.74A260 2、A280/A2601.5时，用Lamber-Beer定律计算： 样本蛋白质含量(mg/ml) =A280/KL=(A280/6.31)10gL 实验样品：牛血清白蛋白：E1%1cm= 6.3100ml/(cm.g) K: 摩尔消光系数； E1%1cm: 百分消光系数。,利用经验公式直接计算样本蛋白质含量,三、BCA（二喹啉甲酸）法测定蛋白质,【原理】,BCA(bicinchoninicacid)与硫酸铜等试剂组成的试剂，混合一起成为苹果绿，即BCA工作试剂。 在碱性条件下，BCA与蛋白质结合时，蛋白质将Cu 2+还原为Cu+，一个Cu+螯合二个BCA分子，工作试剂由原来的苹果绿变成紫色复合物，在一定范围内，颜色深浅与蛋白质浓度成正比。,【优缺点】 1、操作简便，快速； 2、准确灵敏，试剂稳定性好； 测定范围：20-200g/ml；微量：0.5-10g/ml; 3、经济实用，可在微板孔中进行，大大节约样品和试剂用量； 4、抗试剂干扰能力强。,【操作】,待测液请根据具体浓度稀释后测定,原始数据记录,【实验报告】,实验原理 实验步骤 数据记录及实验结果计算 （1）利用直接比较法：Cx=Ax/AsCsVs/Vx （2）标准曲线计算 实验结论,日期、室温,实验项目,