1.2基因工程的基本操作程序PPT课件

2021/7/2311.21.2基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序2021/7/232 基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序2021/7/233为什么要有为什么要有“目的基因的获取目的基因的获取”这一步？这一步？有了目的基因，我们才能赋予一种生物以另一种生有了目的基因，我们才能赋予一种生物以另一种生物的遗传特性。物的遗传特性。2021/7/234真核细胞的基因结构真核细胞的基因结构什么是什么是“目的基因目的基因”？原核细胞的基因结构原核细胞的基因结构2021/7/235 目的基因主要是目的基因主要是_有调控作用的因子有调控作用的因子编码蛋白质的结构基因编码蛋白质的结构基因目前被广泛提取使用目前被广泛提取使用的目的基因有：苏云金的目的基因有：苏云金杆菌杆菌抗虫基因抗虫基因、植物、植物抗抗病基因病基因（抗病毒、抗细（抗病毒、抗细菌菌)、种子、种子贮藏蛋白基因贮藏蛋白基因及人及人胰岛素基因胰岛素基因等。等。2021/7/2362 2）利用）利用PCRPCR技术扩增目的基因技术扩增目的基因未知目的基因的核苷酸序列未知目的基因的核苷酸序列 已知目的基因的核苷酸序列已知目的基因的核苷酸序列 3 3）人工合成）人工合成且基因比较小且基因比较小 且基因比较大且基因比较大 2021/7/237 将含有某种将含有某种生物不同基因的生物不同基因的许多许多DNADNA片段片段，导，导入入受体菌的群体受体菌的群体中储存，各个受中储存，各个受体菌分别含有这体菌分别含有这种生物的不同基种生物的不同基因，称为因，称为基因文基因文库库。1.1.基因文库概念基因文库概念2021/7/2382.2.基因文库的分类基因文库的分类:按外源按外源DNADNA片段的来源分类片段的来源分类种种类类部分基因文库：部分基因文库：只包含了一种生物的只包含了一种生物的部分部分基因，基因，如：如：cDNAcDNA文库文库基因组基因组DNADNA文库：文库：含有一种生物的含有一种生物的全部全部基因基因2021/7/239提取某生物提取某生物全部全部DNA用适当用适当限制酶切割限制酶切割许许 多多DNA片段片段与载体连接与载体连接导入受体菌群导入受体菌群该生物基该生物基因组文库因组文库（每个受体菌含有一段不同的DNA片段）与载体连接与载体连接导入受体菌群导入受体菌群mRNA逆转录酶逆转录酶杂交双链杂交双链核酸酶核酸酶H单链单链DNADNA聚合酶聚合酶双链双链DNA(cDNA)该生物该生物cDNA文库文库2021/7/2310基因组基因组DNADNA文库文库cDNAcDNA文库文库2021/7/2311真核生物转录过程真核生物转录过程2021/7/2312文库类型文库类型cDNAcDNA文库文库基因组文库基因组文库基因多少基因多少文库大小文库大小启动子启动子内含子内含子物种间的基因物种间的基因交流交流基因组基因组DNADNA文库与文库与cDNAcDNA文库的比较文库的比较某种生物某种生物部分基因部分基因某种生物某种生物全部基因全部基因小小大大无无有有无无有有可以可以部分基因可以部分基因可以2021/7/2313 村长村长,为什么要为什么要构建基因文库？直接构建基因文库？直接从含有目的基因的生从含有目的基因的生物中提取不行吗？物中提取不行吗？当然行啊。构建基因文库只当然行啊。构建基因文库只是获取目的基因的方法之一。但是获取目的基因的方法之一。但是，有时我们完全是，有时我们完全不知道目的基不知道目的基因序列因序列，或者想从一种生物体内，或者想从一种生物体内获得获得许多基因许多基因，或者想知道几种，或者想知道几种生物之间有哪些基因不同，或者生物之间有哪些基因不同，或者想知道一种生物在想知道一种生物在不同的发育阶不同的发育阶段段都表达哪些基因，或者想得到都表达哪些基因，或者想得到一种生物的一种生物的全部基因序列全部基因序列，往往，往往就需要构建基因文库。就需要构建基因文库。4.4.基因文库的目的基因文库的目的2021/7/23141 1、概念概念：PCRPCR全称为全称为_，是一项，是一项 在生物在生物_复制复制_的核酸合成技术的核酸合成技术 通过这项技术可在通过这项技术可在短时间内大量扩增目的基因短时间内大量扩增目的基因 因为整个过程是在体外进行，所以又叫做因为整个过程是在体外进行，所以又叫做体外体外DNADNA扩增技术。扩增技术。聚合酶链式反应聚合酶链式反应体外体外特定特定DNADNA片段片段2 2、原理：、原理：DNADNA复制复制 利用利用PCRPCR技术扩增目的基因技术扩增目的基因2021/7/2315四种脱氧核苷酸四种脱氧核苷酸(dNTP)(dNTP)一对引物：一对引物：热稳定热稳定DNADNA聚合酶聚合酶(Taq(Taq酶）酶）模板模板DNA(DNA(需含有目的基因需含有目的基因 )一小段单链一小段单链DNA或或RNA，一般一般2030个碱基个碱基，能与，能与DNA母链母链的一段碱基序列的一段碱基序列互补配对互补配对。已知目的基因的核苷酸序列已知目的基因的核苷酸序列温度控制温度控制2021/7/2316PCR扩增仪扩增仪5 5、方式：、方式：指数指数2 2n n6 6、结果：、结果：使目的基因的片段在使目的基因的片段在短时间内大量短时间内大量地扩增地扩增 以以_方式扩增，即方式扩增，即_（n n为扩增循环的次数）为扩增循环的次数）2021/7/2317扩增过程扩增过程a a、DNADNA变性（变性（90-9590-95）：）：双链双链DNADNA模板模板 在热作用下，在热作用下，断裂，形成断裂，形成_ _ b b、复性（复性（55-6055-60）：）：系统温度降低，系统温度降低，引物引物 与与DNADNA模板结合，形成局部模板结合，形成局部_。c c、延伸（延伸（70-7570-75）：）：在在TaqTaq酶酶的作用下，从的作用下，从 引物的引物的55端端33端延伸，合成与模板互补端延伸，合成与模板互补 的的_。氢键氢键单链单链DNADNA双链双链DNADNA链链2021/7/2318PCR仪仪微量离心管微量离心管2021/7/2319一一 次次 性性吸液枪头吸液枪头调节轮调节轮卸枪头按钮卸枪头按钮推动按钮推动按钮卸枪头器卸枪头器微量移液器微量移液器2021/7/2320利用利用PCRPCR技术扩增目的基因技术扩增目的基因2021/7/2321PCR技术技术DNA复制复制相相同同点点原理原理原料原料条件条件不不同同点点解旋方解旋方式式场所场所酶酶结果结果碱基互补配对碱基互补配对四种脱氧核苷酸四种脱氧核苷酸 模板、能量、酶模板、能量、酶DNADNA在高温下变性解旋在高温下变性解旋解旋酶催化解旋酶催化体外体外复制复制细胞细胞核内核内热稳定的热稳定的DNADNA聚合酶聚合酶细胞内的细胞内的DNADNA聚合酶聚合酶大量的大量的DNA片段片段形成整个形成整个DNA分子分子2021/7/2322通过通过DNADNA合成仪用化学方法人工合成合成仪用化学方法人工合成DNA合成仪合成仪推推测测推推测测合合成成 当当基因比较小基因比较小、蛋白质的氨基酸序列可以测得蛋白质的氨基酸序列可以测得或或核苷酸核苷酸序列已知序列已知时，可采用此种方法。时，可采用此种方法。2021/7/2323为什么要有为什么要有“表达载体的构建表达载体的构建”这一步？这一步？单独的单独的DNADNA片段片段目的基因是目的基因是不能稳定遗传不能稳定遗传的。的。构建表达载体构建表达载体的目的是为了的目的是为了使目使目的基因在受体细胞的基因在受体细胞中稳定存在，并且中稳定存在，并且可以遗传给下一代，可以遗传给下一代，同时使目的基因能同时使目的基因能表达表达和发挥作用。和发挥作用。2021/7/23241.1.用一定的用一定的_切切割载体，使其出现一割载体，使其出现一个切口，露出个切口，露出_。2.2.用用_切断切断目的基因，使其产生目的基因，使其产生_。核心核心3.3.将切下的目的基因片段插入载体的将切下的目的基因片段插入载体的_处，再加入适量处，再加入适量_，形成了一个重组，形成了一个重组DNADNA分子分子限制酶限制酶黏性末端黏性末端同一种限制酶同一种限制酶相同的黏性末端相同的黏性末端切口切口DNADNA连接酶连接酶二、基因表达载体的构建二、基因表达载体的构建DNA连接酶连接酶2021/7/2325c、目的基因、目的基因b、启动子、启动子d、终止子、终止子e、标记基因、标记基因a、复制原点、复制原点2021/7/2326启动子：启动子：位于基因的首端的位于基因的首端的一段特殊的一段特殊的DNADNA片断，它是片断，它是RNARNA聚合酶识别和结合的部聚合酶识别和结合的部位位，有了它才能，有了它才能驱动基因转驱动基因转录出录出mRNAmRNA，最终获得蛋白质。，最终获得蛋白质。终止子：终止子：位于基因的尾端的一段特殊的位于基因的尾端的一段特殊的DNADNA片断，片断，能终止能终止mRNAmRNA的转录。的转录。2021/7/2327三、将目的基因导入受体细胞三、将目的基因导入受体细胞转化转化目的基因进入目的基因进入_内，并且在内，并且在 受体细胞内维持受体细胞内维持_和和_的过程的过程受体细胞受体细胞稳定稳定表达表达2021/7/2328方法方法导入导入植物植物细胞细胞导入导入动物动物细胞细胞导入导入微生物微生物细胞细胞农杆菌转化法农杆菌转化法基因枪法基因枪法花粉管通道法花粉管通道法显微注射法显微注射法 感受态细胞吸收感受态细胞吸收DNADNA分子分子2021/7/2329农杆菌特点：农杆菌特点：易感染易感染双子叶植物双子叶植物和和裸子植物裸子植物。TiTi质粒的质粒的T-DNAT-DNA可转移至受体细胞的染色体上可转移至受体细胞的染色体上2021/7/2330基因枪法基因枪法 基因枪法又称微弹轰击法，是利用基因枪法又称微弹轰击法，是利用压缩气体产生的动力压缩气体产生的动力，将包裹在金属颗粒表面的将包裹在金属颗粒表面的表达载体表达载体-DNA-DNA打入受体细胞中，使目打入受体细胞中，使目的基因与其整合并表达的方法。的基因与其整合并表达的方法。2021/7/2331花粉管通道法花粉管通道法 植物花粉在柱头上萌发后，花粉管要穿过花柱直通胚囊。植物花粉在柱头上萌发后，花粉管要穿过花柱直通胚囊。花粉管通道法就是在植物受粉后，花粉形成的花粉管还未愈合花粉管通道法就是在植物受粉后，花粉形成的花粉管还未愈合前，剪去柱头，然后，滴加前，剪去柱头，然后，滴加表达载体表达载体-DNA-DNA，使目的基因借助，使目的基因借助花粉管通道进入受体细胞。花粉管通道进入受体细胞。2021/7/2332l显微注射法显微注射法提纯含目的基提纯含目的基因表达载体因表达载体取受精卵取受精卵显微注射显微注射移植到子宫移植到子宫受精卵发育受精卵发育新性状动物新性状动物2.微生物作受体细胞原因：微生物作受体细胞原因：将目的基因导入微生物细胞将目的基因导入微生物细胞3.转化方法：转化方法：大肠杆菌大肠杆菌繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少1.常用菌：常用菌：感受态大肠杆菌细胞感受态大肠杆菌细胞Ca2+处理处理大肠杆菌大肠杆菌感受态感受态细胞细胞表达载体表达载体与感受态与感受态细胞混合细胞混合感受态细感受态细胞吸收胞吸收DNA2021/7/2334例：用棉铃饲喂棉例：用棉铃饲喂棉铃虫，如虫吃后不出现铃虫，如虫吃后不出现中毒症状，说明未摄入中毒症状，说明未摄入目的基因或摄入目的基目的基因或摄入目的基因未表达。如虫吃后中因未表达。如虫吃后中毒死亡，则说明摄入了毒死亡，则说明摄入了抗虫基因并得到表达。抗虫基因并得到表达。2021/7/2335(四四)目的基因的检测与鉴定目的基因的检测与鉴定检查是否成功检查是否成功分子分子检测检测个体个体鉴定：鉴定：检测转基因生物染色体的检测转基因生物染色体的DNA DNA 上上是否插入了目的基因是否插入了目的基因检测目的基因检测目的基因是否转录出了是否转录出了mRNAmRNA检测目的基因检测目的基因是否翻译成蛋白质是否翻译成蛋白质抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等方法方法方法方法方法方法DNADNA分子杂交分子杂交分子杂交分子杂交抗原抗原-抗体杂交抗体杂交2021/7/2336DNA附着在膜上附着在膜上硝化纤维素硝化纤维素加探针加探针报告基因（含荧光素分子）报告基因（含荧光素分子）变性变性DNA杂交杂交（如检测（如检测SARS病毒等）病毒等）abcd2021/7/23372021/7/2338无表达产物无表达产物无表达产物无表达产物有表达产物有表达产物无表达产物无表达产物 细菌的检测，将每个受体细胞单独培养形成细菌的检测，将每个受体细胞单独培养形成菌落，检测菌落中是否有目的基因的表达产物。菌落，检测菌落中是否有目的基因的表达产物。淘汰无表达产物的菌落，保留有表达产物的进一淘汰无表达产物的菌落，保留有表达产物的进一步培养、研究。步培养、研究。2021/7/23392021/7/2340基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序n 获取目的基因获取目的基因u 从基因文库从基因文库u 利用利用PCRPCRu 化学方法人工合成化学方法人工合成n 构建基因表达载体构建基因表达载体u 目的基因、启动子、终止子、标记基因目的基因、启动子、终止子、标记基因n 将目的基因导入受体细胞将目的基因导入受体细胞u 农杆菌转化法、基因枪法、显微注射法农杆菌转化法、基因枪法、显微注射法n 目的基因的检测与鉴定目的基因的检测与鉴定u 检测：是否插入、转录、翻译、个体水平鉴定检测：是否插入、转录、翻译、个体水平鉴定2021/7/2341思考：思考：1.1.作为基因工程表达载体，只需含有目的基作为基因工程表达载体，只需含有目的基因就可以完成任务吗？为什么？因就可以完成任务吗？为什么？不可以。因为目的基因在表达载体中得到表达不可以。因为目的基因在表达载体中得到表达并发挥作用，还需要有其他控制元件，如并发挥作用，还需要有其他控制元件，如启动子、启动子、终止子和标记基因终止子和标记基因等。必须构建上述元件的主要理等。必须构建上述元件的主要理由是：由是：（1 1）生物之间进行基因交流，只有使用受体生物生物之间进行基因交流，只有使用受体生物自身基因的启动子才能比较有利于基因的表达；自身基因的启动子才能比较有利于基因的表达；（2 2）通过通过cDNAcDNA文库获得的目的基因没有启动子，文库获得的目的基因没有启动子，只将编码序列导入受体生物中无法转录；只将编码序列导入受体生物中无法转录；2021/7/2342（3 3）目的基因是否导入受体生物中需要有筛目的基因是否导入受体生物中需要有筛选标记；选标记；（4 4）为了增强目的基因的表达水平，往往还为了增强目的基因的表达水平，往往还要增加一些其他调控元件，如增强子等；要增加一些其他调控元件，如增强子等；（5 5）有时需要确定目的基因表达的产物存在有时需要确定目的基因表达的产物存在于细胞的什么部位，往往要加上可以标识存在于细胞的什么部位，往往要加上可以标识存在部位的基因（或做成目的基因与标识基因的融部位的基因（或做成目的基因与标识基因的融合基因），如绿色荧光蛋白基因等。合基因），如绿色荧光蛋白基因等。2021/7/23432.根据农杆菌可将目的基因导入双子叶植物的机理根据农杆菌可将目的基因导入双子叶植物的机理,你能你能分析出不能导入单子叶植物的原因吗分析出不能导入单子叶植物的原因吗?若将一个抗病基因若将一个抗病基因导入小麦中导入小麦中,理论上讲你应该怎样做理论上讲你应该怎样做?要选择合适的农杆菌菌株，因为不是所有的要选择合适的农杆菌菌株，因为不是所有的农杆菌菌株都可以侵染单子叶植物；农杆菌菌株都可以侵染单子叶植物；要加趋化和诱导的物质，一般为乙酰丁香酮要加趋化和诱导的物质，一般为乙酰丁香酮等，目的是使农杆菌向植物组织的受伤部位靠等，目的是使农杆菌向植物组织的受伤部位靠拢（趋化性）和激活农杆菌的拢（趋化性）和激活农杆菌的Vir区（诱导）区（诱导）的基因，使的基因，使T-DNA转移并插入到染色体转移并插入到染色体DNA上。上。酚类化合物酚类化合物 2021/7/23443.3.利用大肠杆菌可以生产出人的胰岛素，联系前面有关利用大肠杆菌可以生产出人的胰岛素，联系前面有关细胞器功能的知识，结合基因工程操作程序的基本思路，细胞器功能的知识，结合基因工程操作程序的基本思路，思考一下，若要生产人的糖蛋白，可以用大肠杆菌吗？思考一下，若要生产人的糖蛋白，可以用大肠杆菌吗？有些蛋白质肽链上有共价结合的糖链，这些有些蛋白质肽链上有共价结合的糖链，这些糖链是在内质网和高尔基糖链是在内质网和高尔基复合体上加工完成的，复合体上加工完成的，内质网和高尔基复合体存在于真核细胞中，大肠内质网和高尔基复合体存在于真核细胞中，大肠杆菌不存在这两种细胞器，因此，在大肠杆菌中杆菌不存在这两种细胞器，因此，在大肠杆菌中生产这种糖蛋白是生产这种糖蛋白是不可能的不可能的。2021/7/2345（1 1）从小鼠中克隆出）从小鼠中克隆出-珠蛋白基因的编码珠蛋白基因的编码序列序列（cDNAcDNA）。）。（2 2）将将cDNAcDNA前接上在大肠杆菌中可以适用的前接上在大肠杆菌中可以适用的启动子启动子，另外加，另外加上上抗四环素的基因抗四环素的基因，构建成一个，构建成一个表达载体表达载体。（3 3）将表达载体）将表达载体导入无四环素抗性的大肠杆菌中导入无四环素抗性的大肠杆菌中，然后在含，然后在含有四环素的培养基上培养大肠杆菌。如果表达载体未进入大肠有四环素的培养基上培养大肠杆菌。如果表达载体未进入大肠杆菌中，大肠杆菌会因不含有抗四环素基因而死掉；如果培养杆菌中，大肠杆菌会因不含有抗四环素基因而死掉；如果培养基上长出大肠杆菌菌落，则表明基上长出大肠杆菌菌落，则表明-珠蛋白基因已进入其中。珠蛋白基因已进入其中。（4 4）培养培养进入了进入了-珠蛋白基因的大肠杆菌，收集菌体，珠蛋白基因的大肠杆菌，收集菌体，破碎破碎后从中提取后从中提取-珠蛋白。珠蛋白。4.-4.-珠蛋白是动物血红蛋白的重要组成成分。当它的成分异珠蛋白是动物血红蛋白的重要组成成分。当它的成分异常时，动物有可能患某种疾病，如镰刀形细胞贫血症。假如常时，动物有可能患某种疾病，如镰刀形细胞贫血症。假如让你用基因工程的方法，使大肠杆菌生产出鼠的让你用基因工程的方法，使大肠杆菌生产出鼠的-珠蛋白，珠蛋白，想一想，应如何进行设计？想一想，应如何进行设计？2021/7/23461.下表关于基因工程中有关基因操作的名词及对下表关于基因工程中有关基因操作的名词及对应的内容，正确的组合是应的内容，正确的组合是2 2、下列属于获取目的基因的方法的是、下列属于获取目的基因的方法的是()()利用利用mRNAmRNA反转录形成从基因组文库中提取反转录形成从基因组文库中提取从受体细胞中提取从受体细胞中提取 利用利用PCRPCR技术技术 利用利用DNADNA转录转录 人工合成人工合成A.A.B.B.C.C.D.D.2021/7/23473.细菌的质粒分子带有一个抗菌素抗性基因，该抗细菌的质粒分子带有一个抗菌素抗性基因，该抗性基因在基因工程中的主要作用是性基因在基因工程中的主要作用是 A提高受体细胞在自然环境中的耐药性提高受体细胞在自然环境中的耐药性 B B有利于对目的基因是否导入进行检测有利于对目的基因是否导入进行检测C C增加质粒分子的分子量增加质粒分子的分子量D D便于与外源基因连接便于与外源基因连接4.4.有关基因工程的叙述正确的是有关基因工程的叙述正确的是A A限制酶只在获得目的基因时才用限制酶只在获得目的基因时才用B B重组质粒的形成是在细胞内完成的重组质粒的形成是在细胞内完成的C C质粒都可作为运载体质粒都可作为运载体 D D蛋白质的结构可为合成目的基因提供资料蛋白质的结构可为合成目的基因提供资料2021/7/23482021/7/2349(多选多选)采用基因工程的方法培育抗虫棉，下列导采用基因工程的方法培育抗虫棉，下列导入目的基因的做法正确的是入目的基因的做法正确的是A.A.将毒素蛋白直接注射到棉受精卵中将毒素蛋白直接注射到棉受精卵中B.B.将编码毒素蛋白的将编码毒素蛋白的DNADNA序列，直接注射到棉受序列，直接注射到棉受精卵中精卵中C.C.将编码毒素蛋白的将编码毒素蛋白的DNADNA序列，与质粒重组，导序列，与质粒重组，导入农杆菌，用该细菌感染棉的体细胞，再进行入农杆菌，用该细菌感染棉的体细胞，再进行组织培养组织培养D.D.将编码毒素蛋白的将编码毒素蛋白的DNADNA序列，与细菌质粒重组，序列，与细菌质粒重组，注射到棉子房并进入受精卵注射到棉子房并进入受精卵C D2021/7/2350 运用现代生物技术，将苏云金芽孢杆菌的抗运用现代生物技术，将苏云金芽孢杆菌的抗虫基因整合到棉花细胞中，为检测实验是否成虫基因整合到棉花细胞中，为检测实验是否成功，最方便的方法是检测棉花植株是否有功，最方便的方法是检测棉花植株是否有 A抗虫基因抗虫基因 B.抗虫基因的产物抗虫基因的产物 C 新的细胞核新的细胞核 D.相应性状相应性状D个人观点供参考，欢迎讨论