紫外吸光光度法测定化妆品中木瓜蛋白酶的活力

紫外吸光光度法测定化妆品中木瓜蛋白酶的活力作者：冯健雯（梧州市产品质量监督检验所，梧州543002）样品用磷酸盐半胱氨酸EDTA缓冲溶液搅拌溶解后，选择一定的pH值和温度条件，样 品中的木瓜蛋白酶能将加入的酪蛋白水解生成可溶解的氨基酸，末水解的酪蛋白用三氯乙酸沉 淀后过滤，溶解的水解产物用紫外吸光光度法测定1。1试验部分1.1试剂与仪器磷酸钠溶液：0.05mol L-1,称取十二水磷酸氢二钠1.79g溶解于100ml水中。柠檬酸溶液：0.05mol L-1,将柠檬酸一水合物1.05 g用100ml水溶解。缓冲溶液:称取十二水磷酸氢二钠17.89 g溶于800ml水中，再将EDTA钠盐二水合物 14.0g和盐酸半胱氨酸一水合物6.1g溶于其中。用1mol L-1盐酸或1mol.LT氢氧化 钠将pH值调到6.00.1,加水定容至1 L。三氯乙酸溶液:将三氯乙酸30 g溶于100ml水中酪蛋白作用物:将1g干燥的酪蛋白分散在50ml磷酸钠溶液中，在沸水浴中加热30min, 经常搅拌之，冷至室温,在连续快速的搅拌下，用柠檬酸溶液调pH值至6.00.1,加水定容至 100ml。标准溶液：1mg ml -1,称取USP木瓜蛋白酶对照标准物100mg （其活力为100PUm g -1）,用磷酸盐半胱氨酸EDTA缓冲溶液溶解，定容100ml。标准使用液:移取0.25,0.50,1.00,1.50,2.00,2.50ml标准溶液于一组10ml容量瓶中, 用缓冲溶液稀释至刻度,摇匀。酸度计:分度值0.1 pH, pH6.00.1。超级恒温水浴:400.1C紫外分光光度计:波长2001000 nm1.2测定方法1.2.1样品处理称取样品1.002.00 g,加磷酸盐半胱氨酸EDTA缓冲溶液搅拌溶解后转移至50ml 容量瓶中，用缓冲溶液稀释至刻度,摇匀。1.2.2测定取一组25mmx150mm的试管（14支）,分别移入酪蛋白作用物5ml （其中6支制作标准 曲线,1支制作样品,7支制作酶和样品空白）。将所有试管于400.1C水中恒温20min后, 迅速向其中7支试管移入上述各标准使用液和样品处理液2ml （此标准系列的浓度分别为 0.025,0.05,0.10,0.15,0.20,0.25mg ml -1）,在旋转混合时开始记时，盖好塞后放入水 浴,60min后，向所有试管加入三氯乙酸溶液3ml，立即旋转混合，在空白管中分别移入各标 准使用液和样品液2ml，将各试管放回水浴，加热30min使沉淀蛋白质全部凝结，用定性滤 纸过滤，弃去开始2ml滤液，用紫外分光光度计，在1 cm石英比色皿中，于波长280 nm处，对 照相应的空白，测定标准和样品（滤液）的吸光度,绘制标准曲线比较。1.2.3计算木瓜蛋白酶单位，其定义为在检测条件下，每1 h释放出相当于Ip g泰乐菌素的酶量,一个木 瓜蛋白酶单位简称1PU。酶活力（EA）2以木瓜蛋白酶单位数/g （PU g-1）表示,按下式计算：EA=（AC x50）/ms式中 AUSP木瓜蛋白酶的活性,PUmg-iC从标准曲线上求得的样品处理液浓度,mgml-1ms样品质量,g50样品定容的体积,ml 2结果与讨论2.1吸收光谱取一定量的USP木瓜蛋白酶标准物，按试验方法操作，在200320 nm范围内绘制吸收光 谱曲线，见图1。最大吸收波长在280 nm处，选此波长作为测定波长。圈1吸收光谱| .酶标准对试剂空白 n试剂空口对水2.2试验条件的选择2.2.1介质的选择试验发现，木瓜蛋白酶不完全溶于水，且几乎不溶于多数有机溶剂，选择磷酸盐半胱氨酸ED TA缓冲溶液溶解较完全，成均匀溶液。2.2.2酸度与温度的选择试验在PH5.57.0的酸度中进行，发现在PH6.06.5范围内，温度40r时，酪蛋白作用 物水解完全，吸光度最大且稳定，选PH6.0,温度40C为测定条件。2.3标准曲线用1mgml -1的酶标准溶液配制标准系列，按试验方法进行测定，并绘制标准曲线,其回归 方程为AA =-0.012 + 3.08 C (mg-ml -1),相关系数r =0.998,测定木瓜蛋白酶的线性范围 为 0 0.25mg -ml -1。2.4分析结果与回收试验取远东美容保健用品有限公司(香港远东索芙集团有限公司)生产的索芙特木瓜系列护肤品做样品分析与回收试验，结果见表1。表1样品分析结果_ 测定最 加入最 测粽总最IE收率-RSI) 样不11 31.231.4 31.4I 0.041 .1 41 .3 41 .2件.70.372 43*43.7 43.5I 0.053 ,6 53 .6 53 .599.00.353 43.043.W 43.2I 0.053.053.053.199.00 .27注:I 样为木瓜口肤护手霜样为木瓜口肤洗而 奶样为木瓜白朕沐浴踞,参考文献：1 李泰森.食品化学药典M.兰州:甘肃省质量能源标准化信息中心,1992.670.2 ZBY40018-1989.加酶洗涤剂中碱性蛋白酶活力的测定S .