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土壤中分解尿素的细菌的分离与计数,一、研究思路,1、PCR技术及提示,2、实验室微生物的筛选原理（P21）,3、选择培养基（阅读配方）,（一） 筛 选 菌 株,人为提供有利于目的菌株的条件（包括营养、温度、pH等），同时抑制或阻止其他微生物生长。,在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基，称做选择培养基。,能分解尿素的细菌的筛选 阅读教材22页第一大段相关内容，并思考回答下列问题：,1.在培养基的配方中，为微生物的生长提供碳源和氮源的分别是是什么物质？,碳源是葡萄糖，氮源是尿素。,2.分析该配方的培养基对微生物是否具有筛选作用？如果有，又是如何进行筛选的？,有筛选作用。尿素是培养基中的唯一氮源，因此，原则上只有能够利用尿素的微生物才能够生长。,答：不一定，有些微生物可以利用其他微生物的代谢产物生长繁殖，因此能够在选择培养基上生长的微生物不一定是所需要的微生物，还需要进一步的验证。,？,3.只要能够在选择培养基上生长的微生物是否就是所需要的微生物？,统计菌落数目的理论依据是： 当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。因此，恰当的稀释度是成功地统计菌落数目的关键。为了保证结果准确，通常将几个稀释度下的菌液都涂布在平板上，培养后再选择菌落数在30300的平板进行计数。,（二） 统计菌落数目,思考题,1.想一想，如何从平板上的菌落数推测出每克样品中的菌落数？,答：统计某一稀释度下平板上的菌落数，最好能统计3个平板，计算出平板菌落数的平均值，然后按课本旁栏的公式进行计算。,实例分析,第一同学只涂布了一个平板，没有设置重复组，因此结果不具有说服力。 第二位同学考虑到设置重复组的问题，涂布了三个平板，但是其中1个平板的计数结果与2个相差太远，说明在操作过程中可能出现了错误，因此，不能简单地将3个平板的计数值用来求平均值。,实例启示,1、在实验设计时，一定要涂布至少3个平板作为重复组，才能增强实验的说服力和准确性 2、在分析实验结果时，一定要考虑所设置的重复组的结果是否一致，结果不一致，意味着操作有误，需要重新实验。,微生物数量测定方法,1、稀释涂布平板法间接技术方法 （注：菌落数往往比活菌数 ）,2、显微镜计数直接计数,（三）设置对照（资料分析）,1、设置对照的目的 2、对照实验概念,资料分析,A同学的结果与其他同学不同，可能的解释有两种。 一是由于土样不同； 二是由于培养基污染或操作失误。,究竟是哪个原因，可以通过实验来证明。,另一种方案： 将A同学配制的培养基在不加土样的情况下进行培养，作为空白对照，以证明培养基是否受到污染。,实验方案有两种,一种方案： 可以由其他同学用与A同学一样的土样进行实 验，如果结果与A同学一致，则证明A无误；如果结果不同，则证明A同学存在操作失误或培养基的配制有问题。,四、实验设计,实验的具体操作步骤如下: 资料一.土壤取样 从肥沃、湿润的土壤中取样。先铲去表层土3 cm左右，再取样，将样品装入事先准备好的信封中。,实验名称：土壤中分解尿素的细菌的分离与计数,（实验案例 ）,在牛肉膏蛋白胨培养基上生长的菌落数目应明显多于选择培养基上的数目，因此，牛肉膏蛋白胨培养基可以作为对照，用来判断选择培养基是否起到了选择作用。,制备培养基： 准备牛肉膏蛋白胨培养基和选择培养基。,将10 g土样加入盛有90 mL无菌生理盐水的锥形瓶中，充分摇匀，吸取上清液1 mL，转移至盛有9 mL的生理盐水的无菌大试管中，依次等比稀释至107稀释度，并按照由107103稀释度的顺序分别吸取0.1 mL进行平板涂布操作。按照浓度从低到高的顺序涂布平板，不必更换移液管。,资料 二.样品的稀释,由于初次实验，对于稀释的范围没有把握，因此选择了一个较为宽泛的范围：稀释倍数为103107。,为什么分离不同的微生物要采用不同的稀释度？测定土壤中细菌的总量和测定土壤中能分解尿素的细菌的数量，选用的稀释范围相同吗？,答：这是因为土壤中各类微生物的数量是不同的，例如在干旱土壤中的上层样本中：好氧及兼性厌氧细菌数约为2 185万，放线菌数约为477万，霉菌数约为23.1万。因此，为获得不同类型的微生物，就需要按不同的稀释度进行分离，同时还应当有针对性地提供选择培养的条件。,思考题,将涂布好的培养皿放在30 温度下培养。随着培养时间的延长，会有不同的菌落产生。 比较牛肉膏培养基和选择培养基中菌落的数量、形态等，并做好记录。 挑选选择培养基中不同形态的菌落接入含酚红培养基的斜面中，观察能否产生如课本中图2-10的颜色反应。如果有则说明该选择培养基中确实含有能分解尿素的细菌。,资料三.微生物的培养与观察,5.细菌的计数,当菌落数目稳定时，选取菌落数在30300的平板进行计数。在同一稀释度下，至少对3个平板进行重复计数，然后求出平均值，并根据平板所对应的稀释度计算出样品中细菌的数目。,五、操作提示,无菌操作,做好标记,规划时间,六、课题成果与评价,（一）培养物中是否有杂菌污染以及选择培养基是否筛选出菌落,对照的培养皿在培养过程中没有菌落生长，说明培养基没有被杂菌污染。牛肉膏培养基的菌落数目明显大于选择培养基的数目，说明选择培养基已筛选出一些菌落。,如果学生选取的是同一种土样，统计的结果应该接近。如果结果相差太远，需要进一步分析产生差异的原因。,（二）样品的稀释操作是否成功,如果得到了2个或2个以上菌落数目在30300的平板，则说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数。,（三）重复组的结果是否一致,2提示：反刍动物的瘤胃中含有大量的微生物，其中也包括分解尿素的微生物。由于瘤胃中的微生物多为厌氧菌，接触空气后会死亡，因此分离其中能分解尿素的微生物除了需要准备选择培养基外，还应参照厌氧菌的培养方法进行实验设计。,课后练习P26,伊红美蓝培养基是鉴别培养基，可以用来检测自来水中的大肠杆菌是否超标，因为的代谢产物与伊红美蓝结合，使菌落呈深紫色并带有金属光泽，使大肠杆菌的菌落显示出来，并没有促进大肠杆菌的生长和抑制其他微生物的生长。,例如：鉴别大肠杆菌培养基,大肠杆菌呈 黑色中心 ,有或无金属光泽,大肠杆菌在伊红美蓝琼脂(EMB)上典型特征,本课题知识小结:,1.尿素是尿素分解菌的氮源，因此在配制培养基时2 A、葡萄糖在培养基中越多越好 B、尿素分解菌有固氮能力，故培养基中只需无机氮 C、尿素在培养基中越少越好 D、尿素分解菌无固氮能力，故培养基中的尿素为化合态氮,多思多得！,2.下列属于菌落特征的是（ ）2 菌落的形状 菌落的大小 菌落的多少 隆起程度 颜色 有无荚膜 A. B. C. D.,
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