酶与细胞的固定化.ppt

第二章 酶与细胞的固定化,引 言,酶是一类由生物细胞产生的具有催化功能的蛋白质。 酶参与生物体内的各种代谢反应,而且反应后其数量和性质不发生变化。,高效率 高度专一性 可调控性 反应条件温和 广泛应用于酿造、食品、医药等领域,酶对环境十分敏感 物理因素：温度、压力、电磁场 化学因素：氧化、还原、有机溶剂、金属 离子、离子强度、pH 生物因素：酶修饰和酶降解 反应速度逐渐下降 反应后不能回收 对于现代工业来说,酶还不是一种理想的催化剂 怎样才能获得理想的生物催化剂?,答案： 固定化酶 固定化细胞,固定化酶与固定化细胞是酶工程研究中的一个广阔领域，前景光明,第一节 酶的固定化,固定化酶是指将水溶性的酶用物理或化学方法处理，使之成为不溶于水的，但仍具有酶活性的酶。反应后的酶可以回收重复使用。,一、固定化酶的定义,固定化酶的优点 极易将固定化酶与底物、产物分开; 可以在较长时间内进行反复分批反应和装柱连续反应; 在大多数情况下,能够提高酶的稳定性; 酶反应过程能够加以严格控制; 产物溶液中没有酶的残留,简化了提纯工艺; 较游离酶更适合于多酶反应; 可以增加产物的收率,提高产物的质量; 酶的使用效率提高,成本降低。,固定化酶存在的缺点 固定化时,酶活力有损失; 增加了生产的成本,工厂初始投资大; 只能用于可溶性底物,而且较适用于 小分子底物,对大分子底物不适宜; 与完整菌体相比不适宜于多酶反应,特 别是需要辅助因子的反应; 胞内酶必须经过酶的分离手续。,二、固定化酶的制备原则 根据应用目的、应用环境，选择固定化的方法 ，都要遵循以下基本原则 ： 必须注意维持酶的催化活性及专一性。 固定化应该有利于生产自动化、连续化。 固定化酶应有最小的空间位阻 酶与载体必须结合牢固,从而使固定化酶能回收贮藏,利于反复使用。 固定化酶应有最大的稳定性,所选载体不与废物、产物或反应液发生化学反应。 固定化酶成本要低,以利于工业使用。,三、固定化方法 酶的固定化方法很多,但对任何酶都适用的方法是没有的, 必须经过实验研究才能确定。,(一)非共价结合法 1.结晶法 使酶结晶从而实现固定化的方法。 2.分散法 通过酶分散于水不溶相中从而实现固 定化的方法。,3. 吸附法 （1）物理吸附法 利用氢键、疏水键等作用力将酶固定于不溶性载体上。 无机吸附剂：高岭土、皂土、硅酸、氧 化铝等 吸附量小、有些酶发生吸附变性 有机吸附剂： 大孔树脂、葡聚糖凝胶、纤维素衍生物、胶原等 吸附量略大(50mg/g载体),不产生变性失活。 比较受重视。,（2） 离子结合法 酶通过离子键结合于具有离子交换基的水不溶性载体的固定化方法。 CM -纤维素、DEAE-纤维素 吸附量 50-150mg/g 优点： 操作方便,条件温和,可再生后反复使用 缺点： 结合力较弱,不适宜的pH,高盐浓度,高底物浓度,高温等往往能把吸附的酶解析下来。,吸附法,可以改善方法： 1.选择最佳条件操作（如温度、pH） 2.选吸附量大的载体，控制酶和载体量， 3.采用高酶量吸附 4.开发新载体 5.对酶进行修饰后再进行交换吸附,(二)化学结合法,1、共价结合法 酶与载体以共价键结合的固定化方法。 分为两类： （1）将载体有关基团活化，然后与酶有关基团发生偶联反应。 （2）在载体上接一个双功能试剂，然后将酶偶联上去。,共价结合法,偶联成功与否取决于： 载体：功能基团，如羟基、芳香氨基， 羧基，羧甲基等 酶分子:侧链非必需基团 （游离的-氨基，lysNH2, Arg-胍基 C-COOH, Asp-羧基，Glu-羧基， 酚羧基，巯基，咪唑基) 但是，载体、酶分子上的基团不会直接反应，其功能基团要活化。,1)重氮化 芳香氨基载体 方法特点： 载体先用亚硝酸处理成重氮盐衍生物，再在温和条件下和酶分子上相应基团直接偶联。,如胰蛋白酶，胰凝乳蛋白酶的固定化，偶联到重氮化的苯胺-多孔玻璃时，得到固化酶具很高酶活性,2） 溴化氰-亚氨碳酸基反应 带羟基的载体在碱性条件下，载体的羟基和溴化氰反应，生成活泼的亚氨碳酸酯衍生物，在弱碱中直接和酶的氨基进行共价偶联。 最后一种是主要产物。,此方法固定化后 相对酶活力比较高， 且相当稳定， 同时操作也简便。 是最受欢迎的一种方法,2. 交联法 利用双功能或者多功能试剂在酶分子之间或者载体之间；酶分子与载体之间进行交联反应而固定化。,双功能试剂： 常用的是戊二醛 O O H C CH2 CH2 CH2 C H,第一篇报道是：戊二醛交联羧肽酶得到一种分子间交联的固定化酶,戊二醛有两个醛基，均可与酶或蛋白质的游离氨基反应,使酶蛋白交联。,此法与共价结合法利用的均是共价键，不同之处：交联法不使用载体。,（三）包埋法（entrapment）,将酶用物理的方法包埋在各种载体（高聚物）内。分为： 网格型：将酶包埋在高分子凝胶细微网格中。 微囊型：将酶包埋在高分子半透膜中。,将聚合物单体和酶溶液混合后，再用聚合促进剂(包括交联剂)的作用而聚合，酶就包埋在载体中达到固定化。酶本身不参与反应，所以较安全。 但在聚合过程中有自由基产生及聚合时放出热，酶与试剂间可能发生化学反应，这些因素可能会使酶失效，或者降低酶活性。操作时注意条件的控制。,1、网格型 常用的包埋剂如：聚丙烯酰胺凝胶。 先把酶与丙烯酰胺单体分散于疏水介质,再进行聚合。 如：葡萄糖-6-磷酸脱氢酶包埋于丙烯酰胺和丙烯酸中，然后再用羰二亚胺活化载体上的羧基而共价偶联固定。,优点: 1.包埋容量10-100毫克蛋白/克单体。 2.改变单体与交联剂比例,控制凝胶孔径的分布,改善酶的持留与底物和产物扩散转移状况。 3.改变单体性质,可调整固定化酶的亲水和亲脂特性。,2、微囊型 常用的微囊型包埋剂有尼龙膜、火棉胶、醋酸纤维素等。 主要是用几十到几百微米、厚度有250的半透膜将酶包埋固定化。半透膜容许小分子底物和产物自由出入囊的内外，囊的表面积相对体积的比值大，底物和产物的交换进行迅速。,制备方法： (1)界面沉淀法 利用某些高聚物在水相和有机相的界 面上溶解度极低而形成皮膜将酶包埋。 A.酶溶液在水不互溶的有机相中乳化 B.加入一种不溶解高聚物的有机溶剂 C.高聚物在油-水界面上沉淀、析出、形 成膜,将酶包埋, D.从有机相移入水相,例：硝酸纤维素固定化酶 酶水溶液 + 硝酸纤维素 乳化分散 加苯甲酸丁酯 纤维素在酶周围凝聚 加Tween 20（乳化剂） 由有机相移入水相 得到火棉胶微囊。 优点： 1）纤维表面积和重量比值高 2) 凝聚后酶稳定性好 3) 包埋量大,(2)界面聚合法 利用亲水性单体和疏水性单体在界面发生聚合的原理包埋酶。 例子：尼龙膜界面聚合包埋 (酶+己二胺水溶液）+（庚二酰氯氯仿溶剂） 混合乳化 二种单体(己二胺和庚二酰氯)在水相、有机相交界处聚合形成包埋酶的尼龙膜珠粒 Tween 20 乳化,得到微囊包埋酶,(3)二级乳化法 酶溶液先在离聚物(常用乙基纤维素、聚苯乙烯等)有机相中乳化分散,乳化液再在水相中分散形成次级乳化液,当有机高聚物溶液固化后,每个固体球内包含着多滴酶液。,各种固定化方法的优缺点比较,四、固定化酶的性质 由于固定化也是一种化学修饰,酶本身的结构必然受到扰动,同时酶固定化后,其催化作用由均相移到异相,由此带来的扩散限制效应、空间障碍、载体性质造成的分配效应等因素必然对酶的性质产生影响。,(一)固定化后酶活性的变化 固定化酶的活力在多数情况下比天然酶小,其专一性也能发生改变。 固定化酶的活力要低于等摩尔原酶的活力的原因可能是 ： 1.构象改变 主要指活性中心构象改变，导致活性降低，从实验可以知道这些情况在吸附和共价偶联方法中出现。与固定化过程有关，与载体性质有关，或者两者都有关。,2立体屏障： 指载体孔径太小，或者固定化方法引起位置不当，使酶活性中心或者调节中心造成空间障碍，酶和底物无法结合。 这种情况定量测定十分困难，也无法预测。 但是当用大孔径胶，或者用吸附和共价偶联法把酶固定于纤维素一类载体上，或者在酶和载体之间加一个“臂”，情况可以改变。,3. 见P43 4. 见P43,(二)固定化对酶稳定性的影响 在大多数情况下酶经过固定化后其稳定性都有所增加 Merlose选择50种固定化酶,就其稳定性与固定化前的酶进行比较 30种酶经固定化后稳定性提高, 12种酶无变化, 8种酶稳定性降低。,酶稳定性： 总体来讲 1）酶固定化后，酶活性构型更牢固，增加酶的稳定性 2）酶固定化后，更加有利于阻止不利因素对酶的侵袭，如变性剂、抑制剂的抵抗力。 3）限制了酶分子之间的相互作用，和减少蛋白酶的破坏作用。 4）固定化后可延长酶的操纵和保存的有效期限。,1、热稳定性和最适温度上升 最适温度与酶稳定性有关。 多数酶固定化后热稳定性上升，最适温度也上升,如：氨基酰化酶， 70，15分钟，酶没有了活性。 固定化后， 70，15分钟， 有80%,2、对各种有机试剂及酶抑制剂的稳定性提高,固定化酶的最适pH变化 酶由蛋白质组成,其催化能力对外部环境特别是pH非常敏感。酶固定化后,对底物作用的最适pH和酶活力-pH曲线常常发生偏移。,第三节 细胞的固定化 目前的情况有超过固定化酶的趋势。 原因:1.降低成本; 2.固定化细胞比固定化酶简便; 3.可作为单一酶使用，也可作复合酶系完成部分代谢和发酵过程。,一、固定化细胞的分类,二、固定化细胞的制备方法,a) 直接固定法,不使用载体，借助物理（如加热、冰冻）、化学方法（如柠檬酸、各种絮凝剂）将细胞直接固定。 一般只用于单酶或少数几种酶催化的反应。,例如：葡萄糖异构酶(白色链霉菌)，是一种胞内酶。在50-80加热10分钟，使菌体自溶作用的酶失活，而葡萄糖异构酶仍然保持活性，长期使用酶活力不减少。,b)吸附方法 c)包埋方法,实 验： 2.4%左右的卡拉胶 ，70 溶解, 再冷却到 42, +10%左右的细菌菌体(预热到42） 迅速混合均匀 4 冰箱放置大约30min 取出后切成33mm的小颗粒,作用：固定顺式环氧琥珀酸水解酶产生菌细胞，利用固定化细胞的胞内酶转化顺式环氧琥珀酸盐生产L(+)酒石酸,COOHCOOH | | C E HCOH |O +H2O | C OHCH | | COONaCOOH 顺式环氧琥珀酸盐 L(+)酒石酸 有生产厂用1吨固定化细菌体,生产10吨L(+)酒石酸,第四节 固定化酶与固定化细胞 的应用研究进展,乙酰 -DL Ala L Ala +乙酸 乙酰 -D Ala,一、在工业生产上的应用 1. 氨基酰化酶（Aminoacylase） 世界上第一种工业化生产的固定化酶,2.葡萄糖异构酶 世界上生产规模最大，应用最为成功的一种固定化酶。,二、固定化酶在医学上的应用 1. 消血栓 纤溶酶是异源蛋白质，在人体内引起免疫反应，无法长期使用。 酶的不稳定性使其在较短的时间内失活。 用包埋法制备的酶固定化技术可克服上述弊端，酶在囊中不能漏出，小分子物质能自由进出。,2. 人工肾 原理：将病人血液中的尿素经脲酶水解成氨，再用活性炭吸附。即：用固定化脲酶和微胶囊活性炭组成人工肾。,酶传感器 固定化酶和电化学传感器的结合。 优点： 既有不溶性酶体系的优点，又具有电化学电极的高灵敏度； 酶的专一反应性，使其具有较高的选择性，能够直接在复杂试样中进行测定。,三、在分析检测中的应用,Sensitive and specific Rapid Simple,Biosensor,1967年Updike等采用酶的固定化技术，将葡萄糖氧化酶固定在疏水膜上，然后再和氧电极结合，组装成了世界上第一个生物传感器葡萄糖氧化酶电极。,葡萄糖酶电极,酶电极示意图 D葡萄糖O2 D葡萄糖酸1，5内酯H2O2,半透膜,酶胶层,感应电极,Glucose,Gluconic acid,Glucose oxidase,Oxygen,Hydrogen peroxide,Membrane,Electrode,根据反应中消耗的O2、生成的葡萄糖酸和H2O2的量，可以用氧电极、pH电极和H2O2电极来测定葡萄糖的含量。,1）酶传感器的原理,生物传感器 由生物识别单元（如酶、微生物、抗体等）和物理转换器相结合所构成的分析仪器。,生物识别元件(Biological recognition element),是酶、抗原(体)、细胞器、组织切片和微生物细胞等生物分子经固定化后形成的一种膜结构，对被测定的物质有选择性的分子识别能力。,换能器(Transducer),将识别元件上进行的生化反应中消耗或生成的化学物质，或产生的光或热等转换为电信号，并呈现一定的比例关系。,酶传感器工作原理示意图,酶传感器主要由固定化酶膜和变换器组成： 固定化酶膜：选择性地“识别”并催化被检测物质发生化学反应； 变换器：把催化反应中底物或产物的变量转换成电信号，通过仪表显示出来。,2）酶传感器的应用,水质监测 用化学法测定酚时，硫化物、油类等可干扰其测定。 从马铃薯中提纯、经吸附交联得到的固定化多酚氧化酶与氧电极构成酚传感器，可检测大多数酚类化合物。,德国研发的环境废水BOD分析仪,医疗方面 葡萄糖传感器和血糖测定仪 用葡萄糖氧化酶（glucose oxidase,GOD）制成葡萄糖传感器，可测定血液中葡萄糖浓度。,手掌型葡萄糖(glucose)分析仪,SBA-50型单电极生物传感分析仪,SBA-70型血糖乳酸自动分析仪,食品鲜度 鱼鲜度传感器 在日本、加拿大等国广泛用于鱼类鲜度的测定。鱼死后体内ATP经酶解依次形成ADP、AMP、IMP、肌苷、次黄嘌呤和尿酸。鲜度可用K值表示： K=肌苷+次黄嘌呤/ ATP +ADP+AMP+IMP +肌苷+次黄嘌呤+尿酸,大多数鱼死后520h，ATP，ADP和AMP已分解尽，超过24h，鲜度主要取决于IMP-肌苷-次黄嘌呤-尿酸。 将这三个步骤的三种酶（5核苷酸酶、核苷磷酸化酶、黄嘌呤氧化酶）固定在氧电极上，制成鱼鲜度测定仪。 当K20时，鱼极新鲜，可供生食。 K在2040之间为新鲜，必须熟食。 K大于40，不新鲜，不宜食用，这与嗅觉检验结果相一致。,肉鲜度传感器,肉类在腐败过程中会产生各种胺类，故胺类测定能反映肉类的新鲜程度。 用腐胺氧化酶与过氧化氢电极构成多胺生物传感器，或用单胺氧化酶膜和氧电极组成的酶传感器测定肉在贮藏过程中的鲜度。,污染微生物及病原菌的检测,1通过免疫学方法，即获得相应的特异性抗原和抗体进行分析和检测。,第五节 固定化酶反应器,连续流搅拌桶式反应器,Continuous Stirred tank reactor,CSTR 催化剂采用颗粒状的固定化酶，少数应用片状固定化酶。运转过程中要不断分出部分反应液，同时补充等量的新鲜底物溶液，为不致使酶随反应液流失，所以在它的出口处通常有滤膜。,填充床式反应器,床内用颗粒状或片状固定化酶填充，运转时，底物按一定方向以恒定速度通过反应床。使用最普遍.,连续搅拌桶式超滤反应器,CSTR/Ultrfitration reactor,CSTR/UFR 由连续流搅拌桶式反应器和超滤装置组合而成，为小分子量产物与高分子底物的分离、底物较彻底的转化以及溶液酶或固定化酶的反复使用提供了可能。但酶易因循环超滤而失效损失。,流 动 床 式反 应 器,Fluidized bed reactor,FBR 底物溶液以足够大的流速向上通过固定化酶床层，使固体颗粒处于流化状态。混合程度高，故传热、传质情况良好。可用于处理粘性强和含有固体颗粒的底物，或用于需要供应气体或排放气体的反应。,循环流式反应器,Recycle reactor,RCR 把部分流出物与加料流混合，然后再令其进入反应器。特点是可以提高液体的流速和减少底物向固定化酶表面传递的阻力。,固定化酶反应器的选择依据,固定化酶的形状 底物的物理性质 酶反应动力学特性 酶的稳定性 操作要求及反应器费用,1、固定化酶的形状,一般言之，颗粒状或片状固定化酶对连续流搅拌桶式反应器和填充床式反应器类型的反应器均可适用。但膜状和纤维状的固定化酶则不适于连续流搅拌桶式反应器。 另一方面，如果固定化酶易变形、易粘结或颗粒细小时，那么在填充于填充床式反应器后，往往会引起高的压力降和堵塞床层，并且在大规模生产中无法实现高的流率。此时宜采用流动床式反应器。,2、底物的物理性质,底物分三种情况：溶解性物质、颗粒物质与胶状物质。溶解性底物显然对任何类型反应器均不会造成困难。 颗粒状和胶状底物则往往会导致床层堵塞，对此可用循环流式反应器或流动床式反应器。 连续流搅拌桶式反应器只要搅拌速度足够高，能维持底物和固定化酶良好的悬浮状态，也可用于颗粒状底物。但高的搅拌速度会导致固定化酶从载体上被剪切下来，所以转速不能太高。,3、酶反应动力学特性,一般而言，填充床式反应器在固定化酶反应器中占有主导地位，它适合于产物抑制的场合。,4、酶的稳定性,在反应器操作过程中，由于搅拌浆或液流的剪切作用，常会使固定的酶从载体上脱落下来，或由于磨损，引起粒度的减小而影响固定化酶的操作稳定性，其中尤以连续流搅拌桶式反应器最为严重。 为解决这一问题而改进反应器设计，是把酶直接粘接在搅拌轴上，或把固定酶设置在与轴相连的金属网篮内。,5、操作要求及反应器费用,连续流搅拌桶式反应器是最便宜的，它结构简单，且具有良好的操作性，适应性强；而其他类型的反应器，则都需为特定的生产过程专门设计和制造。在讨论反应器价格的同时，还应该考虑固定化酶本身的费用，及在各种反应器中的稳定性。,