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专题20微生物的利用、酶的应用,特色梳理,题型演练,选考提升,微生物的培养与利用 1.培养基及无菌技术 (1)微生物对培养基的需求,特色梳理,题型演练,选考提升,(2)常见无菌操作 对于培养皿、试管、三角瓶、镊子等常采用高压蒸汽灭菌法灭菌。 对于不能加热灭菌的化合物,如尿素等,只能用G6玻璃砂漏斗过滤。 实验操作过程中,一般采用灼烧对接种环和玻璃刮刀进行灭菌。 为避免周围环境中微生物的污染,实验操作应在酒精灯火焰旁进行。,特色梳理,题型演练,选考提升,2.微生物分离方法比较,特色梳理,题型演练,选考提升,特色梳理,题型演练,选考提升,3.大肠杆菌(微生物)的培养与分离操作 (1)原理:接种在LB液体培养基中使其快速分裂增殖;将待检测微生物样品通过划线分离或涂布分离法接种在LB固体培养基上,样品中的每一个细胞或孢子都可以生长繁殖形成单个菌落。 (2)流程,特色梳理,题型演练,选考提升,4.分离以尿素为氮源的微生物 (1)实验原理 筛选以尿素为氮源的微生物,使用以尿素为唯一氮源的选择培养基进行培养。 有些细菌含有的脲酶能通过降解尿素作为其生长的氮源。 细菌含有的脲酶能将尿素分解成氨,使培养基的碱性增强,pH升高,从而使加入酚红指示剂的培养基变红。,特色梳理,题型演练,选考提升,(2)操作步骤,特色梳理,题型演练,选考提升,题型 微生物培养的基本操作 典例精析常见的酿酒酵母只能利用葡萄糖而不能利用木糖来进行酒精发酵,而自然界中某些酵母菌能分解木糖产生酒精,但是对酒精的耐受能力差。科学家利用基因工程培育了能利用这两种糖进行发酵且对酒精耐受能力强的酿酒酵母。请分析回答下列问题。 (1)制备酵母菌培养基要进行倒平板操作,待平板冷凝后,要将平板倒置,其主要原因是。,特色梳理,题型演练,选考提升,(2)取从自然界中采集的葡萄,用无菌水将葡萄皮上的微生物冲洗到无菌的三角瓶中,然后按图甲所示过程进行酵母菌的纯化培养。,特色梳理,题型演练,选考提升,图乙是经过图甲过程A纯化培养的结果,在培养基上接种时划线的顺序依次是。 A.B. C.D. 接种环通过灼烧灭菌,完成图中划线操作,共需灼烧接种环次。 A.1次B.2次 C.3次D.4次 研究者在图甲过程C的操作培养过程中,得到了一个经培养后菌落分布如图丙所示的平板,推测接种时可能的操作失误是。 (3)将培养基上的酵母菌菌株转接到仅以为碳源的培养基中,无氧条件下培养一周后,有些酵母菌死亡,说明这些酵母菌不能利用木糖发酵。,特色梳理,题型演练,选考提升,(4)将目的基因连接到具有尿嘧啶合成酶基因作为标记基因的质粒上,然后将所得的重组质粒导入酵母菌时,应选择缺乏 能力的酿酒酵母作为受体菌。 (5)将经上述流程培育获得的转基因酿酒酵母接种在含的培养基中进行酒精发酵能力测试。随着发酵的持续进行,若该酿酒酵母能够存活,说明它能,即说明所需菌株培育成功。,答案:(1)防止皿盖上的冷凝水落入培养基造成污染(2)BD涂布不均匀(3)木糖(4)尿嘧啶合成(5)葡萄糖和木糖利用葡萄糖和木糖产生酒精,且对酒精的耐受能量强(合理即可),特色梳理,题型演练,选考提升,解析:(1)倒平板操作时,需对冷凝后的平板倒置,主要原因是防止皿盖上的冷凝水落入培养基造成污染。(2)分析图示可知,图乙分离方式为划线分离,划线分离的基本原理是在划线的过程中,随着接种环上的菌液逐渐减少,划线最后部分的细菌间距离加大。因此,接种越靠前的区域,菌落越密集,反之稀疏,故在培养基上接种时划线的顺序依次是。接种环每次划线之前均需要灼烧,由图示3个区域的菌落可知,接种环划线3次,由于接种结束之后还要对接种环进行灼烧,以杀死接种环上残留的菌种,故可知接种环总共灼烧4次。图丙中,菌落密度适宜,说明菌液稀释程度适宜,但是菌落未均匀分布在培养基上,推测可能是接种时涂布不均匀造成的。(3)题干要求筛选能够分解木糖产生酒精的酵母菌,故该培养基要以木糖为唯一碳源。,特色梳理,题型演练,选考提升,(4)由题意知,目的基因连接到具有尿嘧啶合成酶基因作为标记基因的质粒上,即接受该重组质粒的酵母菌可以合成尿嘧啶合成酶,合成尿嘧啶,因此应选择缺乏尿嘧啶合成能力的酿酒酵母作为受体菌。(5)将获得的转基因酿酒酵母接种在含葡萄糖和木糖的培养基中进行酒精发酵能力测试。随着发酵的持续进行,若该酿酒酵母能够存活,说明它能利用葡萄糖和木糖产生酒精,且对酒精的耐受能量强,即说明所需菌株培育成功。,特色梳理,题型演练,选考提升,易错点拨(1)若配制的培养基中有葡萄糖,为防止葡萄糖分解碳化,一般要用500 g/cm2压力(90 以上)灭菌30 min;不能加热灭菌的化合物,如尿素等,只能用G6玻璃砂漏斗过滤。 (2)使用高压锅灭菌,计时时间不是高压锅通电后,而是有压力后开始计时灭菌15min;灭菌结束,不是灭菌锅压强降为0停止,而是与大气压相同时打开锅盖。 (3)对于培养基pH的调节,需在灭菌之前。 (4)使用涂布分离法时,首先将目的菌液进行梯度稀释,通常稀释105107倍,每个浓度梯度下做三个培养皿,通常每个培养皿中有20个以内的单菌落最为合适。 (5)涂布分离时,由于菌体的叠加以及操作过程中菌体的死亡,因此,稀释涂布后统计菌落数往往比活菌的实际数目低。 除玻璃刮刀上的酒精,以防止酒精对培养皿中微生物的伤害。,特色梳理,题型演练,选考提升,(6)玻璃刮刀未用时保存在70%酒精中,用时需放在酒精灯火焰上灼烧,主要目的是消除玻璃刮刀上的酒精,以防止酒精对培养皿中微生物的伤害。,特色梳理,题型演练,选考提升,【热点变式】回答与微生物分离有关的问题。 由于酵母菌直接利用淀粉的能力很弱,有人将地衣芽孢杆菌的-淀粉酶基因转入酵母菌中经筛选得到了可高效利用淀粉的工程酵母菌菌种(过程如图甲所示)。回答下列问题。,特色梳理,题型演练,选考提升,(1)图甲中,过程需要的酶有。为达到筛选目的,平板内的固体培养基应以作为唯一碳源。过程需要重复几次,目的是进一步筛选纯化获得。 (2)某同学尝试过程的操作,其中一个平板经培养后的菌落分布如图乙所示。该同学的接种方法是;推测该同学接种时可能的操作失误是。 (3)上述工程酵母菌培养过程中,有关操作正确的是。 A.玻璃刮刀和接种环一样,只需灼烧灭菌 B.培养基分装到培养皿后进行灭菌 C.倒平板和取菌液都必须在酒精灯火焰旁进行 D.获得的菌种如果需要保存,可置于37 恒温保存,特色梳理,题型演练,选考提升,答案:(1)限制性核酸内切酶、DNA连接酶淀粉分解淀粉能力强的酵母菌 (2)涂布分离法涂布不均匀 (3)C,特色梳理,题型演练,选考提升,解析:(1)图甲中过程表示基因表达载体的构建,该过程先要用同种限制性核酸内切酶切割含有目的基因的外源DNA分子和质粒,再用DNA连接酶将目的基因和载体连接起来形成重组质粒。普通酵母菌直接利用淀粉的能力很弱,而工程酵母菌可以高效利用淀粉,所以用以淀粉为唯一碳源的选择培养基可以分离出工程酵母菌。过程重复几次的目的是纯化获得分解淀粉能力强的酵母菌。 (2)由图乙可知,该同学采用的是涂布分离法,但菌落比较集中,没有很好的分散开来,可能是涂布不均匀导致的。 (3)玻璃刮刀需先用70%的酒精消毒,然后再灼烧灭菌;培养基先进行灭菌后分装到培养皿;倒平板和取菌液都必须在酒精灯火焰旁进行;获得的菌种如果需要保存,若临时保存则置于4 温度下保持,若长期保存则置于-20 温度下保存。,特色梳理,题型演练,选考提升,微生物培养所需技巧总结 (1)灭菌方式归纳,特色梳理,题型演练,选考提升,特色梳理,题型演练,选考提升,(2)划线分离与涂布分离应用,特色梳理,题型演练,选考提升,(3)接种环的灼烧,特色梳理,题型演练,选考提升,特别说明第一次划线及每次划线之前都需要灼烧接种环。 灼烧的接种环,待其冷却后才能伸入菌液,以免温度太高杀死菌种。 划线时,只能蘸取一次菌液,每次划线以上次的末端为起点,划线最后一个区不要与第一个区相连。 (4)凝固剂的选择 琼脂:未被纯化的混合物,主要成分为琼脂糖和琼脂果胶,还含有少量的含氮化合物,及其他有机杂质和不溶性杂质。 琼脂糖:纯化物质,不含有含氮化合物。 (5)检测培养基灭菌是否彻底的技巧 将未接种的培养基放在适宜温度下培养一段时间后观察是否有菌落生长,若培养基中出现菌落,说明培养基灭菌不彻底或被污染,反之说明培养基灭菌彻底。,特色梳理,题型演练,选考提升,酶的应用 1.果胶及果胶酶 关于果胶的两点说明:果胶的作用:粘合细胞;果胶的鉴别方式:果胶不溶于乙醇,滴加95%乙醇出现沉淀。,特色梳理,题型演练,选考提升,2.固定化酶的制作原理与方法,特色梳理,题型演练,选考提升,3.-淀粉酶的固定化及淀粉水解作用的检测,特色梳理,题型演练,选考提升,题型一 果汁中的果胶和果胶酶 典例精析1(2016浙江4月选考,32节选)请回答与“果汁中的果胶和果胶酶”实验有关的问题。 (1)果胶是细胞壁的重要组成成分,其化学本质是(A.蛋白质B.脂质C.核酸D.多糖)。它在细胞壁的形成过程中的主要作用是将相邻的细胞在一起。 (2)制取果汁时,先用果胶酶将果胶分解成和半乳糖醛酸甲酯等物质,再用酶处理,可得到比较澄清的果汁。用适量且浓度适宜的上述两种酶处理时,果汁的出汁率、澄清度与酶的高低呈正相关。 (3)由于果胶不溶于乙醇,故可用乙醇对果胶粗提物(经酶处理后的混合物)进行处理,从而得到干制品。,特色梳理,题型演练,选考提升,答案:(1)D粘合(2)半乳糖醛酸果胶甲酯活性(3)脱水(沉淀),易错点拨(1)果胶酶不是一种酶,而是一类酶的总称,包括果胶酶、果胶甲酯酶等。 (2)制备果汁时,果胶酶的活性可以通过果汁的出汁率和澄清度反映出来;而果汁的澄清度或出汁率的高低与果胶酶的活性或数量有关。 (3)果胶不溶于乙醇,可以利用无水乙醇制备果胶沉淀物然后将其烘干后,用于各种生产实践,如一些黏合剂等。,特色梳理,题型演练,选考提升,题型二 固定化酶技术及实践应用 典例精析2酶经过固定化后,不仅能提高酶的稳定性,而且容易与产物分开,具有可反复使用等优点。下图为利用枯草杆菌生产-淀粉酶及酶固定化实验流程图,回答有关问题。,(1)筛选高表达菌株的最简便方法之一是。一般通过、两种手段实现。筛选出的菌株在发酵生产之前还需利用培养基进行扩大培养。 (2)利用物理或化学的方法将-淀粉酶固定在的介质上成为固定化酶。,特色梳理,题型演练,选考提升,(3)上图是实验室中-淀粉酶的固定化装置示意图。实验过程涉及两次蒸馏水洗涤反应柱的操作,所用的蒸馏水体积为装填体积的,第二次洗涤的目的是除去。,特色梳理,题型演练,选考提升,(4)若上图中的液体X为淀粉溶液,从反应柱下端接取少量流出液进行KI-I2颜色测试,结果未呈现红色。下列有关此现象的解释错误的是() A. 反应柱中没有-淀粉酶被固定 B. 流速过快淀粉未被水解 C. 接取的流出液是蒸馏水 D. 流速过慢淀粉被水解成葡萄糖,答案:(1)单菌落分离划线分离(稀释)涂布分离液体(2)非水溶性(3)10倍残留的淀粉溶液(4)D,特色梳理,题型演练,选考提升,技巧点拨-淀粉酶的固定化及淀粉水解作用的检测实验中两次洗涤固定化酶柱目的,特色梳理,题型演练,选考提升,【热点变式】(2018浙江4月选考,32节选)回答与果胶、淀粉等提取和利用有关的问题。 某植物富含有果胶、淀粉、蛋白质和纤维素成分。某小组开展了该植物综合利用的研究。 (1)果胶提取工艺研究结果表明,原料先经过一段时间沸水漂洗的果胶得率(提取得到的果胶占原料质量的百分率)显著高于常温水漂洗的果胶得率,最主要原因是沸水漂洗(A.有助于清洗杂质和去除可溶性糖B.使植物组织变得松散C.使有关酶失活D.有利于细胞破裂和原料粉碎制浆)。 (2)在淀粉分离生产工艺研究中,为促进淀粉絮凝沉降,添加生物絮凝剂(乳酸菌菌液),其菌株起重要作用。为了消除絮凝剂中的杂菌,通常将生产上使用的菌液,采用,进行单菌落分离,然后将其,并进行特性鉴定,筛选得到纯的菌株。,特色梳理,题型演练,选考提升,(3)在用以上提取过果胶和淀粉后的剩渣加工饮料工艺研究中,将剩渣制成的汁液经蛋白酶和纤维素酶彻底酶解处理后,发现仍存在浑浊和沉淀问题。可添加使果胶彻底分解成半乳糖醛酸,再添加,以解决汁液浑浊和沉淀问题。 (4)在建立和优化固定化酶反应器连续生产工艺研究中,通常要分析汁液中各种成分的浓度和所用酶的活性,然后主要优化各固定化酶反应器中的(答出2点即可)、反应pH和酶反应时间等因素。其中,酶反应时间可通过来调节。,答案:(1)C(2)划线分离法(或涂布分离法)扩大培养(3)果胶酶和果胶甲酯酶淀粉酶使淀粉分解(4)固定化酶的量、反应液温度控制反应器液体流量(或体积),特色梳理,题型演练,选考提升,解析:(1)植物体中存在果胶酶,果胶酶能催化果胶的水解,沸水漂洗后会使果胶酶失去活性,所以先经过一段时间沸水漂洗的果胶得率(提取得到的果胶占原料质量的百分率)显著高于常温水漂洗的果胶得率。 (2)纯化菌种常使用划线分离法或涂布分离法,通过扩大培养进行特性鉴定,筛选得到纯的菌株。 (3)果胶酶和果胶甲酯酶能使果胶彻底分解成半乳糖醛酸,淀粉在水中溶解度比较小,也是造成汁液浑浊的原因,所以可用淀粉酶催化淀粉的水解。 (4)本题考查连续生产工艺,反应器中底物的量、酶制剂的量、反应液的温度、反应液的pH、反应时间等都会影响产物的生成率。单位时间内流经反应器的液体流量大,反应时间就短,反之则长。,特色梳理,题型演练,选考提升,1.果汁中果胶和果胶酶实验的注意事项 (1)探究果胶酶的用量是建立在探究最适温度和pH对果胶酶活性影响的基础之上的。此时,研究的变量是果胶酶的用量,其他因素都应保持不变。 (2)实验时可以配制不同浓度的果胶酶溶液,也可以只配制一种浓度的果胶酶溶液,然后使用不同的体积即可。需要注意的是,反应液的pH必须相同,否则将影响实验结果的准确性。 (3)果胶不溶于乙醇,故用酒精沉淀法制取果胶。果胶酶和果胶甲酯酶可水解果胶,瓦解植物的细胞壁和胞间层。有些微生物,如黑曲霉、苹果青霉等都可用于生产果胶酶。在果汁生产中应用果胶酶可以提高出汁率(果汁量)和澄清度。,特色梳理,题型演练,选考提升,2.固定化酶和直接使用酶比较,
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