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第33讲克隆技术,考点克隆技术,1.（2018浙江4月选考节选）回答与基因工程和植物克隆有关的问题： 取田间不同品种水稻的幼胚，先进行，然后接种到培养基中培养，幼胚发生形成愈伤组织，并进行继代培养。用含重组质粒的农杆菌侵染愈伤组织，再培养愈伤组织，以便获得抗虫的转基因水稻。影响愈伤组织能否成功再生出植株的因素有：培养条件如光温、培养基配方如植物激素配比、以及_（答出2点即可）。,解析植物组织培养的程序是：（1）配制培养基；（2）取外植体并消毒；（3）将组织块放在培养基上培养，经脱分化形成愈伤组织，愈伤组织再分化形成再生植株。影响愈伤组织能否成功再生出植株的因素是教材23页提到的：不同种类或同种植物不同基因型个体之间遗传物质的差异，细胞全能性的表达程度不相同，在多次继代培养后，会丧失细胞全能性的表达能力。 答案消毒脱分化水稻的基因型、愈伤组织继代的次数,2.（2017浙江11月选考节选）回答与植物克隆和动物克隆有关的问题： （1）利用植物愈伤组织获得再生植株主要有两条途径：一是由愈伤组织的细胞先分化产生芽和根后再形成一个完整植株的途径，二是由愈伤组织细胞产生胚状体后再萌发形成完整植株的胚胎发生途径。另外也可不通过愈伤组织阶段而直接采用带腋芽的茎段培养成丛状苗，再诱导生根获得再生植株，其原因是腋芽中存在。 （2）利用植物克隆培育新品种，一方面可利用带有目的基因的侵染植株，或将目的基因通过的方法导入植物细胞、组织或器官获得转基因植株，另一方面利用异源植株的进行融合产生杂种植株，或利用异源植物在试管内进行，对其产生的胚进行培养产生杂种植株。,（3）下列属于植物克隆和动物克隆共有的培养方法是。 A.悬浮培养、器官培养 B.贴壁培养、传代培养 C.器官培养、愈伤组织培养 D.原生质体培养、传代培养,解析（1）外植体经脱分化后形成愈伤组织，由愈伤组织形成再生植株主要有两条途径：一是由愈伤组织的细胞再分化产生芽和根后再形成一个完整植株是植物组织培养的器官发生途径，二是由愈伤组织的细胞产生胚状体后再萌发成完整植株是植物组织培养的胚胎发生途径。不通过愈伤组织阶段而直接采用带腋芽的茎段培养成丛状苗，这说明腋芽中含有分生组织，而分生组织中含较高的细胞分裂素，细胞分裂素与生长素之比较高可促进芽的生长。,（2）将目的基因导入植物细胞，可以用含有目的基因的农杆菌直接侵染，或者用显微注射法导入；用异源植物可以利用植物体细胞杂交技术或者受精之后的胚胎进行培养，也可以获得杂种植株。 （3）贴壁生长是动物细胞培养时的特性；愈伤组织是指植物细胞在组织培养过程中形成的一种排列疏松而无规则的无定形状态、高度液泡化的薄壁细胞，动物细胞无愈伤组织培养；传代培养应用于动物细胞培养过程中。 答案（1）器官发生分生组织 （2）农杆菌显微注射原生质体受精 （3）A,3.（2016浙江10月选考节选）某小组欲进行烟草原生质体分离与培养的研究。请回答： （1）原生质体的分离：在无菌条件下，取烟草无菌苗的叶片，放入含有0.5 mol/L甘露醇（维持较高渗透压）的混合液处理，经过离心纯化后获得原生质体。 （2）原生质体的培养：将原生质体进行培养，重新长出细胞壁，形成胚性细胞。此时，应该培养基中甘露醇浓度，以利于胚性细胞继续培养形成细胞团，然后经两条途径形成再生植株。途径一：细胞团经球形胚、和胚状体，最后发育成植株。途径二：细胞团增殖为愈伤组织，然后在发芽培养基上诱导出芽，切割芽经过生根后形成完整植株。上述发芽培养基中含量相对较高的激素是，胚性细胞的主要特点是：。（A.液泡小、细胞核小B.液泡大，细胞核大C.液泡大，细胞核小D.液泡小、细胞核大） （3）为了对烟草的某些性状进行改良，分离到两种烟草的原生质体后，通过方法将他们的遗传物质组合在一起，经培养获得具有新性状的再生植株。提取再生植株的DNA，采用扩增相关基因，来鉴定遗传物质是否成功重组。,解析（1）原生质体取得，需要在较高渗透压的甘露醇溶液中，将植物细胞用纤维素酶和果胶酶处理，去除细胞壁，从而得到原生质体。（2）当原生质体再生出细胞壁后，应当降低培养基中甘露醇浓度，否则将会影响细胞的分裂和生长。胚性细胞继续培养形成细胞团。然后经球形胚、心形胚和胚状体，最后发育成植株。发芽培养基中含量相对较高的激素是细胞分裂素，而生长素含量较低。胚性细胞的主要特点是细胞质丰富、液泡小而细胞核大。（3）分离到两种烟草的原生质体后，可以通过原生质体融合的方法将他们的遗传物质组合在一起，经培养获得具有新性状的再生植株。在体外扩增相关基因的方法是采用PCR技术。 答案（1）纤维素酶和果胶酶（2）降低心形胚细胞分裂素D（3）原生质体融合PCR,本题组对应选修三P21P37，克隆技术,1.植物组织培养的基本程序 配制培养基从的植株上切取小组织块培养获得新植株的再生。 2.原生质体的获得方法 在0.50.6 mol/L的 溶液环境（较高渗透压）下，用 和混合液处理根尖、叶片、愈伤组织或悬浮培养细胞，除去，获得的原生质体。 3.植物细胞工程的概念和操作过程 培养植物细胞（原生质体），借助的方法，将外源遗传物质（DNA）导入受体细胞（包括原生质体受体）中，或通过、等将不同来源的遗传物质重新组合，再通过对这些转基因细胞或重组细胞进行培养，获得具有特定性状的新植株。,半固体,消毒,愈伤,组织,甘露醇,纤维素酶,果胶酶,细胞壁,球形,基因工程,细胞融合,显微注射,4.影响植物克隆的因素 （1）培养的外界条件：如温度、pH （2）培养基：营养物质和激素配比 （3）不同种类植物或同种植物的不同个体之间遗传物质的差异 （4） 培养的次数,光照,基因型,继代,一、植物克隆 1.技术基础：。 2.理论基础 植物细胞的 原因：植物体的每个生活细胞都具有 。 3.植物细胞的全能性的实现条件 （1）离体 （2）适当的（包括水、无机盐、维生素、氨基酸等） （3）适宜条件（、温度、湿度、等） （4）物质。,植物组织培养,全能性,完整的全套遗传物质,营养,蔗糖,无菌,光照,生长调节,4.植物克隆的多种途径,胚胎发生途径是： 器官发生途径是：,或,或,5.植物克隆技术的应用 （1）实现工厂化的植物快速繁殖 （2）生产，恢复品种的性状 （3）生产重要的，如药物、色素、香料、杀虫剂等 （4） （植物细胞工程）：转基因作物，突变体选择，单倍体育种,脱毒苗,次生代谢产物,育种,二、动物的克隆 1.动物细胞、组织培养 （1）动物克隆的技术基础是。 （2）动物（成纤维）细胞培养的过程：,动物的细胞和组织培养,原代培养,传代培养,胰酶消化,分瓶,细胞系,有限细胞系,连续细胞系,细胞株,有限细胞株,连续细胞株,（3）动物细胞培养必需传代的原因：细胞培养到一定时期，细胞会因为密度过大造成，或者因为代谢消耗引起，不能正常生长。 （4）原代培养和传代培养的含义 原代培养：从 取出后立即进行的细胞、组织培养的过程。 传代培养：将分成若干份，接种到若干份培养基中，使其继续生长、增殖。,接触抑制,营养枯竭,机体,原代培养细胞,2.细胞系和细胞株 （1）细胞系：是指可连续传代的细胞，可分为细胞系（恶性细胞系：具有异体致瘤性；“良性”细胞系：保留接触抑制现象，不致癌）和细胞系。 （2）细胞株：通过一定的选择或纯化方法，从中获得的具有 的细胞。可分为 细胞株和 细胞株。,连续,有限,原代培养物或细胞系,特殊性质,连续,有限,3.克隆培养法 （1）概念：把 单细胞从群体中分离出来单独培养，使之繁衍成一个新的 的技术。单抗等都是应用克隆培养法建立的。 （2）基本要求：必须肯定所建成的克隆来源于。 （3）提高细胞克隆形成率的措施有：选择适宜的培养基；添加； 以支持生长；刺激；使用； 调节。,一个,细胞群体,细胞株,单个细胞,血清,滋养细胞,激素,CO2培养箱,pH,4.动物的克隆繁殖 （1）动物难以克隆的根本原因是体细胞中基因，细胞质中存在。 （2）动物体细胞核成功克隆的原因：去除了的限制。“多莉”诞生说明：动物 仍能表现全能性；胚胎和个体发育中，细胞质具有 作用。,（3）绵羊“多莉”克隆过程,选择性表达,调节因子,核基因表达,体细胞核,调控,营养限制性,融合,八细胞,胚胎,移植,同期发情,（4）克隆羊获得成功的部分原因：重组卵细胞最初分裂时虽然复制了DNA，但 并未开始；同时，供体核DNA开始丢失来源于乳腺细胞的；在重组卵细胞开始分裂时，原乳腺细胞的调节蛋白便全部被中的蛋白因子替换了，因此核DNA被重新编排，胚细胞开始基因，进而调控胚在代孕母亲子宫中的进一步发育。因此，采用技术，选择细胞进行移植，并在核移植前对乳腺细胞进行了培养，有利于细胞核的一系列变化和细胞融合后基因表达的的启动。,基因的转录,调节蛋白,第三次,卵细胞质,表达自己的,电脉冲细胞融合,分裂3次时的,营养限制性,分子开关,5.单克隆抗体 （1）制备过程：,（2）单克隆抗体的特点：、。,抗原,骨髓 瘤细胞,杂交 瘤细胞,产生特定抗体,单克隆 抗体,特异性强,灵敏度高,解析过程中只发生了有丝分裂，没有发生减数分裂；组织培养过程都需要细胞分裂素、生长素；阶段为脱分化；X是经过脱分化过程形成的愈伤组织，细胞高度液泡化，排列疏松而无规则。 答案D,2.下图表示通过克隆技术获得烟草植株的过程，请回答：,（1）过程往往选取烟草叶片的幼嫩部位需经过 处理，才能置于培养基中进行培养。 （2）过程称为 ，过程称为。,（3）通过悬浮培养形成的单细胞可发育成，继而形成植物幼体；也可利用水解细胞壁，获得，培养后也可形成植株。 （4）在培养过程中，若要诱导芽的产生，则配制植物激素时要。 A.添加适量的生长素和适当减除其他某些激素 B.适当配比的生长素和细胞分裂素 C.添加适量的生长素和适当增加其他某些激素 D.适当增加细胞分裂素和生长素的量 （5）烟草细胞很容易再生出新植株，但在长期培养过程中，其器官形成能力下降，不可能的原因是 。 A.染色体畸变或细胞核变异B.组织或细胞中的激素平衡被打破 C.产生了缺乏成胚性的细胞系D.植物细胞全能性丧失,解析（1）表示获得外植体的过程，该过程需要对外植体进行消毒处理，才能进行植物组织培养。（2）和分别表示外植体脱分化为愈伤组织和愈伤组织再分化成胚状体的过程。（3）将愈伤组织置于液体培养基中进行悬浮培养获得单细胞，该单细胞可直接发育成胚状体，进而发育成幼体；还可经纤维素酶和果胶酶处理，去除其细胞壁，获得原生质体，通过对原生质体进行培养获得植株。（4）通过平衡植物激素（或植物生长调节剂）配比，能够诱导根或芽的分化，适当配比的生长素和细胞分裂素能够诱导芽的分化，添加适量的生长素和适当减除其他某些激素能够诱导根的分化。（5）在植株的长期组织培养过程中，培养物的器官形成能力下降的原因主要有：染色体畸变或细胞核变异或非整倍体产生，组织或细胞中的激素平衡被打破，细胞对外源生长物质的敏感性发生改变，产生了缺乏成胚性的细胞系等。 答案（1）消毒（2）脱分化再分化（3）幼胚（胚状体）纤维素酶和果胶酶原生质体（4）B（5）D,脱分化和再分化的比较,角度2围绕动物的克隆考查科学实践能力 3.下列关于动物细胞培养的叙述，错误的是（） A.在培养基中加入胰岛素可提高动物细胞克隆形成率 B.细胞克隆可以从普通细胞系中分离出缺乏特殊基因的突变细胞系 C.连续细胞系可认为是发生了转化的细胞系，大多数具有二倍体核型 D.无限细胞系比有限细胞系更容易克隆 解析胰岛素可促进葡萄糖等物质转运进入组织细胞，A正确；细胞克隆即克隆培养法，是将单一细胞从细胞群体中分离出来单独培养形成纯系的技术，从普通细胞系中分离出单个突变细胞即可采用这种方法培养成细胞系，B正确；连续细胞系大多具有异倍体核型，C错误；无限细胞系增殖能力更强，更易克隆，D正确。 答案C,4.（2018浙江超能全能生联考）如图表示动物细胞克隆和制备单克隆抗体的相关过程，请回答相关问题：,（1）过程常应用方法导入重组诱导基因后得到干细胞；部分干细胞经过诱导可分化成全身的不同组织或器官，说明这些细胞具有性。,（2）该过程利用了甲细胞具有的能力，甲和乙细胞可经过生物诱导剂的作用形成丙细胞。取一个丙细胞，放在含大量失去的小鼠成纤维细胞的特定培养体系中培养，最后产生大量的细胞群，这种方法为法。 （3）下列关于经和过程得到单克隆抗体的叙述，错误的是（） A.该过程应用了细胞膜具有流动性的原理 B.丙细胞要具有分泌多种抗体的能力 C.该过程应用了动物细胞融合和动物细胞培养技术 D.丙细胞的形成先通过筛选得到杂交瘤细胞，再进行抗体检验,解析（1）图中的过程常应用显微注射法导入重组诱导基因后得到干细胞；部分干细胞经过诱导可分化成全身的不同组织或器官，说明这些细胞具有发育全能性。 （2）该过程利用了甲细胞具有的连续分裂能力，甲和乙细胞可经过生物诱导剂（灭活的仙台病毒）的作用形成丙细胞。取一个丙细胞，放在含大量失去增殖力的小鼠成纤维细胞的特定培养体系中培养，最后产生大量的细胞群，这种方法为克隆培养法。 （3）细胞融合的过程应用了细胞膜具有流动性的原理，A正确；丙细胞只能分泌单一的抗体，B错误；该过程应用了动物细胞融合和动物细胞培养技术，C正确；丙细胞的形成先通过筛选得到杂交瘤细胞，再进行抗体检验，D正确。 答案（1）显微注射发育全能（2）连续增殖（灭活的）仙台病毒增殖力克隆培养（3）B,1.植物组织培养与动物细胞培养的异同,2.列表法比较细胞系和细胞株,3.植物体细胞杂交与动物细胞融合的比较,
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