化学毒物的一般毒性作用.ppt

第6章 一般毒性作用及评价,2,一般毒性：基础毒性，实验动物单次、多次或长期染毒所产生的总体毒性综合效应； 特殊毒性：三致作用和生殖毒性。,化学毒物的一般毒性作用研究是毒理学工作中非常重要的内容。毒物的一般毒性作用观察是毒理学的经常性工作，对防治外源化学物所致急慢性中毒，对毒理学安全性评价和危险度评定，制订卫生标准以及管理毒理学的决策方面均具有十分重要的意义。,根据接触毒物的时间长短，一般毒性的实验方法分为： 急性毒性 短期重复剂量 亚慢性毒性 慢性毒性,第一节 急性毒性试验,In 1984, 5,000 people died and 30,000 were permanently disabled due to exposure to methyl isocyanate（异氰酸甲酯，MIC） from an industrial accident in India Many people die each year from inhaling carbon monoxide （CO）from faulty heaters,机体（实验动物或人）一次或24h内多次接触外源化学物后在短期内所产生的毒性效应，包括一般行为和外观改变、大体形态变化以及死亡效应。,一、急性毒性的概念,急性毒性（acute toxicity）,实验动物接触化学物的方式或途径不同， “一次”的含义也有所不同 经口和注射接触，“一次”是指在瞬间将受试化学物输入实验动物体内 经呼吸道吸入与经皮肤接触，“一次” 是指在一个特定的期间内实验动物持续地接触受试化学物的过程 所以“一次”含有时间因素,化学物使实验动物发生中毒效应的快慢和剧烈的程度，可因所接触的化学物的质与量不同而异 有的化学物在实验动物接触致死剂量的几分钟之内，就可发生中毒症状，甚至死亡 而有的化学物则在几天后才显现中毒症状和死亡，即迟发死亡,急性毒性的概念,需要注意,急性接触的次数：一次，24h多次 中毒效应出现的时间 不仅以接触毒物后毒性症状出现的时间，主要以接触毒物的时间，观察时间：714天 强度：一次性大剂量，中毒症状明显，常发生死亡,二、急性毒性试验的目的,求出致死剂量及其他急性毒性参数 观察中毒表现、毒作用强度和死亡情况，初步评价毒物的毒效应特征、靶器官、剂量反应（效应）关系和对人体产生损害的危险性 为其他毒理试验提供接触剂量和选择观察指标的依据 为毒理学机制研究提供线索,总体原则,三、急性毒性试验方法的要点,实验动物 染毒途径 染毒剂量 观察周期 观察指标的选择、计算方法和评价,急性毒性反应与人近似 易于饲养、操作方便 繁殖力较强，数量较大 价格较低，易于获得,（一）实验动物的选择和要求,主要原则,实验动物的物种和品系,啮齿类（rodent species）,非啮齿类（nonrodent species）,小鼠：昆明种、NIH、ICR,大鼠：Sprague-Dawley(SD)、Wistar,犬或猴,实验动物的物种和品系,首先选择哺乳动物，其中以大小鼠为最常用。 急性皮肤毒性实验：成年大鼠、豚鼠或家兔，优先考虑白色家兔。 急性吸入毒性实验和经口毒性实验：优先考虑大鼠。,根据接触途径选择实验动物,大鼠：180-240g 小鼠：18-25g 家兔：2-2.5kg,实验动物的年龄和体重,刚成年、健康、未曾交配和受孕的动物 小动物根据体重 同一次试验同一批实验动物体重变异范围不应超过平均体重的20%,实验动物的性别,雌雄各半 如雌、雄动物毒效应有明显差异，应分别并求出雌性和雄性动物的LD50值 特殊的试验研究可仅作单一性别的急性毒性试验,实验动物分组与数量,根据组数和每组数量来决定数量 LD50，一般为4-6组 大、小鼠每组10只，犬类6只 严格遵循随机化的原则,实验动物的预检,给药前检疫观察 大、小鼠、兔、豚鼠1周，犬猴23周 适应新环境，减少环境和生理条件变化可能对试验结果的影响 筛检健康状况不符合试验要求的动物,实验动物的给药前禁食处理,经口途径染毒，实验动物胃肠道内食物存留量对化学毒物的毒性可产生较明显的干扰 大、小鼠隔夜禁食，染毒2h后提供饲料 经口多次染毒可不禁食,（二）受试物及处理,受试物的接受、分样、保管、称量、配制以及在此过程中的严格的质量保证是急性毒性试验成功与否的重要环节。,（二）受试物及处理,常用剂型：水溶液、混悬液、油溶液 所用的溶剂和助溶剂应该是基本无毒的，与受试物不起反应 水溶性受试物，蒸馏水、去离子水、生理盐水，保持与体内渗透压一致 水不溶性受试物，溶于或悬浮于适当的有机溶剂中 受试物一般应临用前新配,（二）受试物及处理,急性毒性试验受试物给予动物染毒的量有规定。常用实验动物和染毒途径的适宜容积（最大容积）分别为：大鼠灌胃1.0（3.0）ml/100g体重（BW）；小鼠灌胃0.1（0.4）ml/10g（BW）。,适宜容积染毒,毒性较大的受试物给药量较小 毒性较低的受试物常需较大量的染毒 给药容积根据染毒途径和实验动物 经口：20ml/kg(空腹动物) 经皮：2ml/kg 静脉：1ml/kg(5min以上),受试物及处理,(三) 染毒方法,应考虑人在生产和生活环境中接触该化学毒物的情况，通常根据实验目的、化学毒物的性质和用途、人类实际接触途径和方式来选择染毒途径。,(三) 染毒方法,模拟实际接触的途径和方式 有利于不同化学物之间结果的比较 受试物的性质和用途 受试物毒性评价程序的要求,工业毒物：经呼吸道、皮肤 农用化学物：经口、皮肤、呼吸道 药品：经口、注射、皮肤 食品：经口 环境污染物：经口、呼吸道、皮肤,染毒途径,消化道、呼吸道、皮肤、注射,染毒途径影响受试物急性毒性,不同途径的吸收量和吸收速率,吸收速率：静脉注射呼吸道腹腔注射肌内注射皮下注射消化道皮内注射经皮 同一受试物不同染毒途径LD50的大小通常符合上述规律,经口（胃肠道）染毒,LD50值来比较不同化学物急性毒性大小,灌胃：溶液或混悬液，以注射器经导管注入胃内，等容量灌胃法 吞咽胶囊：将受试物装入胶囊中，放至舌后部，迫使动物咽下。犬、猴 喂饲：将受试物掺入动物饲料或饮水中供实验动物自行摄入,灌胃法,急性实验多采用灌胃法。小鼠的灌胃针长约45cm，直径为1mm，大鼠的灌胃针长约68cm，直径约1.2mm。灌胃针的尖端焊有一小圆金属球，金属球为中空的。焊金属球的目的是防止针头刺入气管或损伤消化道。针头金属球端弯曲成20左右的角度，以适应口腔、食道的生理弯曲度走向。,用左手固定鼠，右手持灌胃器，将灌胃针从鼠的口腔插入，压迫鼠的头部，使口腔与食道成一直线,将灌胃针沿咽后壁慢慢插入食道，可感到轻微的阻力,此时可略改变一下灌胃针方向，以刺激引起吞咽动作，顺势将药液注入。一般灌胃针插入小鼠深度为34cm，大鼠或豚鼠为46cm。常用灌胃量小鼠为0.21ml，大鼠14ml，豚鼠15ml,鼠类的灌胃法,经呼吸道染毒,经呼吸道染毒（inhalation）： 研究生产条件下以气体、蒸气、粉尘、烟、雾等形式存在的化学毒物和评价环境空气污染物。,静式吸入染毒 动式吸入染毒,经呼吸道染毒,气管内注入,吸入染毒,静式吸入染毒,将一定量的易挥发的静态化学毒物或一定体积的气态化学毒物加入到具有一定体积的密闭容器内，使实验动物吸入染毒。,静式吸入染毒,方法：一定体积的密闭容器，加入易挥发的液态或气态受试物 染毒柜体积、动物数、时间，依据实验动物最低需气量计算 优点：简单、方便、受试物消耗少，适合于小鼠 缺点：氧气减少，浓度不稳定，经皮吸收，不适合稍大动物，挥发性,动式吸入染毒,将实验动物处于有空气流动的染毒柜中，新鲜空气不断流入，污染空气不断流出。温度、湿度、氧及二氧化碳分压相对恒定，并有随时补充受试物，维持浓度稳定。可采样监测受试物浓度，可持续接触受试物，无时间限制。,动式吸入染毒装置的组成,染毒柜 机械通风系统 配气系统,38,动式吸入染毒设备,动式吸入染毒方式分类,动式吸入接触（动式染毒） 面罩接触（面罩吸入染毒）,动式吸入染毒优缺点,优点：受试物浓度和氧分压较稳定 缺点：设备要求高，消耗受试物量很大，操作比较复杂，费时费工,气管注入法,经喉插入法、气管穿刺法、暴露气管穿刺法 优点：染毒剂量较准确，用毒物量少；形成中毒模型速度快。 缺点：操作易造成损伤，引起动物死亡；不能发挥上呼吸道的防卫作用，与自然吸入有差异。,经皮肤染毒,液态、气态甚至粉尘状态的化学毒物 多选择家兔和豚鼠，采用动物脊柱两侧皮肤脱毛（剪毛法、剃毛法、拔毛法、化学脱毛法） ，局部涂敷受试化学毒物并以玻璃钟罩、油纸或塑料薄膜覆盖固定一定的时间。,经皮肤染毒,农药、化妆品、工业毒物、环境污染物、外用药物 常用大鼠 染毒方式：,脱毛：化学或机械法脱毛（体表面积的10%） 染毒：局部涂敷或大鼠、小鼠浸尾法,经注射途径染毒（ingestion）,进行化学毒物的毒作用机制研究、比较毒性研究、了解化学毒物代谢与毒物动力学参数或对急救药物进行筛选研究。 腹腔注射、静脉注射（大、小鼠尾静脉、兔耳静脉）、肌内注射、皮下注射等。,45,经注射途径染毒,（四） 剂量选择,参考新化学物的理化性质 参考相关资料 先用少量动物，以较大的剂量间隔染毒，找出10%-90%（或0%-100%）的致死剂量范围，然后设计正式实验的剂量和分组 根据试验所选的LD50计算方法确定剂量组数,了解化学毒物的理化特性，纯度，杂质成分与含量等,有相关毒性资料可供参考者,没有毒性资料可供查阅者,预试验,找出大致致死范围(即死亡率从0-10%至90-100%),设计正式试验的剂量和分组,近似化学物的LD50(LC50)值作预期毒性中间剂量，上下各设计12个剂量组,最大耐受量试验,各组剂量的计算,i =（lgLD90-lgLD10）/（n-1）,或 i =（lgLD100- lgLD0）/（n-1）,i为组距，n为设计的剂量组数。以最低剂量值（LD0或LD10）的对数剂量加上一个i值，即是第二个剂量组的对数剂量，依次类推直至最高剂量组,49,霍恩法（Horn）：平均移动内插法（moving average interpolation） 改进寇氏法 Bliss法：最大似然性法（maximum likelihood method），最精确的计算方法,LD50的几种计算方法,50,霍恩法,设4个剂量组 每组动物数相等，一般为4只或5只 各剂量公比为10。结果可查表求出LD50及其95%可信限。 由于动物数量较少，其95%可信限范围大，适用于预试验较好。,51,改进寇氏法,各组实验动物数相等，一般为10只 各剂量组剂量呈等比级数排列，至少有5个剂量组 死亡率呈正态分布，最低剂量组死亡率小于20%，最高剂量组死亡率高于80%，所选剂量对数差值相等。,化学物LD50大于2g/kg 或5g/kg，表明毒性不大 我国药品的毒理研究指导原则规定要以最大容积最高浓度给予动物后未见死亡,不必计算LD50,化学毒物的LD50（LC50）的测定一般要求计算实验动物接触受试物后14天内的总死亡数。,试验周期,全面观察动物的各种反应和变化，仔细分析实验动物在染毒后出现的中毒表现、剂量效应、时间分布。观察记录的内容：,（五） 毒性作用观察,中毒体征及发生过程 死亡情况和时间分布 体重 病理形态学变化,（五） 毒性作用观察,中毒体征及发生过程,详细观察和记录动物出现的中毒体征 发生时间 体征发展的经过 各个系统的特征 初步确定急性毒性靶器官 不同表现提供毒性机制的信息,57,58,续表6-1 啮齿类动物急性中毒表现,死亡情况和时间分布,实验动物的死亡数对LD50值产生明显影响 分析中毒死亡时间的分布规律可以提供重要信息：原形，代谢,60,久效磷小鼠经口与腹腔注射染毒，均呈现染毒剂量增加，死亡时间缩短，呈直线负相关，这提示实验动物致死原因是化学物原形所致； 过氧化二磷酸二环己酯给大鼠腹腔注射后呈现明显的染毒剂量对数值与死亡时间呈负相关关系，但给小鼠腹腔注射后，染毒剂量与死亡时间无明显相关。这提示可能与该化学物在大鼠和小鼠体内代谢不同有关。,体重,体重可反映动物中毒后的整体变化。对存活动物尤其是对低于LD50剂量组的存活动物，应在观察期14天内称量其体重的变化，以便了解受试物引起毒效应的持续时间。,体重,反映动物中毒后综合性整体变化，比较客观简便的量化指标 应定期多次称量动物的体重变化，一般为每周1次或2次 对体重指标的变化要仔细观察和分析,体重变化的原因,影响食欲或消化系统的功能 影响食物的吸收和利用 影响水的摄取 肾功能急性损伤,病理检查,死亡动物：大体病理变化，如脏器外观、大小、色泽的变化，有无充血、出血、水肿或其他改变 存活动物：观察期结束时应进行解剖检查，必要时做组织病理学检查,（六） 观察时间和周期,染毒以后应即刻开始观察动物中毒表现和死亡情况 给药当天应连续或多次观察，以后可根据情况，每天2次或多次观察直至试验周期结束,观察周期一般为14天 LD50(LC50)计算时以观察周期内各组动物的总死亡数为依据 不同化学物质引起动物中毒体征出现的时间不同，而且引起死亡的时间存在个体差异 速杀型化学毒物仅计算24h的死亡率,（六） 观察时间和周期,急性毒性试验求出LD50(LC50)值，通过LD50值进行急性毒性分级(acute toxicity classification)，评价毒物的急性毒性强弱，比较毒物的急性毒性大小,四、急性毒性分级和评价, 不论我国或国际上的急性毒性分级标准均还存在不少缺点，因为它们主要是根据经验确定，客观性还不足 目前还没有全世界公认、统一的毒性分级标准,急性毒性分级,69,70,按照急性毒性分级标准评价毒性大小是相对粗略的分级 报告：LD50、急性毒性级别；中毒体征、出现体征时间、死亡前征兆、死亡时间和剂量组间分布、存活动物的体重变化和恢复情况、死亡动物的病理变化,急性毒性分级,举 例,文献：曹静祥, 治洪, 余淑懿, 等. 硼硒联合对大鼠的急性毒性和亚慢性毒性研究. 卫生研究, 2002,31(4):297-299. 中国预防医学科学院环境卫生与卫生工程研究所,前言 单独的硒、单独的硼均有抗氟作用，有研究表明硼硒联合作用使氟中毒大鼠的康复效果较好。因此，我们在硼硒抗氟药效实验研究的基础上，为了解硼硒联合毒性作用，为现场人群应用硼硒联合防治氟中毒提供试验依据，我们就硼硒联合对大鼠的急性毒性及亚慢性毒性进行试验研究,举 例,主要试剂：四硼酸钠、亚硒酸钠 急性毒性试验：参照霍恩氏（Horn）法，选用80只成年大鼠，雌、雄各半，平均体重220g，随机分为8组。受试物用蒸馏水溶解，动物禁食16小时，经口灌胃一次染毒，观察两周内动物的死亡数，查表计算LD50,举 例,材料与方法,四硼酸钠与亚硒酸钠联合对大鼠的急性毒性实验：根据亚硒酸钠和四硼酸钠的半数致死量，将受试物按比例混合并用蒸馏水溶解，40只，随机分为4组。应用预测与实测LD50的对比法评价两种毒物之间的联合作用性质,举 例,材料与方法,急性毒性试验：急性硒中毒动物在服药5min后出现急性硒中毒症状，最初表现为呕吐、腹泻，然后呼吸困难，四肢痉挛，直至死亡。急性硼中毒动物在服药60min后出现急性中毒症状，表现为不好动、腹泻、口鼻出血，甚至惊厥死亡,举 例,结 果,举 例,结 果,联合作用评价结果,结 果,LD50：四硼酸钠对雌、雄性大鼠1470mg/kg。亚硒酸钠对雄性大鼠14.70mg/kg，对雌性大鼠6.81mg/kg。联合对大鼠的急性毒性，雄性大鼠为1727.10mg/kg，雌性大鼠1717.94mg/kg,讨 论,我国工业毒物急性毒性分级标准评价：本实验四硼酸钠与亚硒酸钠混合毒物属于低毒类物质。该毒物的值可为亚慢性毒性实验提供染毒剂量水平的设计依据,讨 论,第二节 蓄积毒性作用,蓄积作用(accumulation): 当化学毒物反复多次给动物染毒、化学毒物进入机体的速度(或总量)超过代谢转化的速度和排泄的速度(或总量)时，化学毒物或其代谢产物就有可能在机体内逐渐增加并贮留。化学毒物容易蓄积的组织和器官称为储存库(depot)。机体常见的储存库有血浆蛋白、脂肪组织、肝脏、肾脏、骨骼等。, 蓄积作用是发生慢性中毒的物质基础 一种外源化学物有无蓄积作用是评定该化学物是否可能引起潜在慢性中毒的论据之一，也是制定卫生限量标准时安全系数的一种依据,物质蓄积( material accumulation ) ：实验动物反复多次接触化学物后，用化学分析方法能够测得机体内存在该化学物或其代谢产物 功能( 损伤 )蓄积( functional accumulation)：有的化学物在长期接触后，机体内虽不能测出其原型或代谢产物，却出现了慢性毒性作用,功能蓄积可能是 由于贮存体内的化学物或其代谢产物的数量极微，不能检出物质的蓄积 或者是由于每次机体接触化学物之后 所引起的损害累积所致,蓄积系数(accumulation coefficient) 是多次染毒使半数动物出现效应(或死亡)的累积剂量ED50(n)与一次染毒使半数动物出现相同效应(或死亡)的剂量ED50(1)的比值，即： ED50(n) LD50(n) K= 或 K= ED50(1) LD50(1),87,第三节 短期、亚慢性、慢性毒性作用,88,一、短期重复剂量毒性,短期重复剂量毒性：实验动物或人连续暴露外源化学物1430天所产生的中毒效应。 短期重复剂量毒性试验具有预备和筛选的性质，尤其是28天短期毒性试验，基本成为一种初步估计长期暴露可能引起毒效应的经济实用的短期重复毒性试验。,89,二、亚慢性毒性作用,90,亚慢性毒性(subchronic toxicity) 是指人或实验动物连续接触较长时间、较大剂量的化学毒物所产生的中毒效应。 接触时间通常指介于单次染毒和10%动物寿命的范围，通常为16个月 。 较大剂量是相对低剂量而言，没有明确的剂量范围下限，上限一般小于急性LD50。,（一）基本概念,91,1. 研究受试物亚慢性毒性剂量反应（效应）关系，确定未观察到有害作用的剂量（NOAEL）和其观察到有害作用的最低剂量（LOAEL），提出安全限量参考值。,（二）亚慢性毒性试验的目的,92,2.观察受试物亚慢性毒性效应谱、毒作 用特点和毒作用靶器官。 3.观察受试物亚慢性毒性作用的可逆性。 4.为慢性毒理试验的剂量设计和观察指标选择提供依据。,（二）亚慢性毒性试验的目的,93,5. 为在其他试验（急性、亚急性、其他动物种属的亚慢性试验等）中发现的或未发现的毒作用提供新的信息，比较不同动物物种毒效应的差异，为受试物毒性机制研究和将研究结果外推到人提供依据。,（二）亚慢性毒性试验的目的,94,（三）亚慢性毒性试验方法的要点,1. 实验动物的选择,（1）种属和品系 （2）性别、年龄和动物数 （3）微生物学寄生虫学等级和饲养环境,95,啮齿类和非啮齿类：大鼠、犬和猴 经皮毒性试验，可用兔或豚鼠。 大鼠常用Wistar和Sprague Dawley。 犬多选用Beagle犬。,（1）种属和品系,96,雌雄各半。 选择离乳不久的动物，大鼠6-8周龄（体重80-100g） 同组动物体重相差不应超过平均体重 的10%，组间平均体重不超过5% 大鼠、小鼠每组不少于20只，犬、猴 每组不少于6只,（2）性别、年龄和动物数,97,亚慢性毒性试验周期较长，观察指标较多，实验动物的质量、喂饲条件和试验环境明显影响受试物的毒性反应。 实验动物分四级：普通级、清洁级、无特定病原体级（SPF级）、无菌级。,（3）微生物学寄生虫学等级和饲养环境,98,使用清洁级及以上等级大小鼠，饲养在屏障环境内进行试验。 保持符合规范的温度、日温差、湿度、换气次数、气流速度、压强梯度、落下菌数、空气洁净度、氨浓度、噪声和照度。,（3）微生物学寄生虫学等级和饲养环境,99,环境严格控制人员、物品和环境空气的进出。 合理营养的饲料，洁净的饮水，清洁无污染的垫料和笼具。 不同项目的试验应分室进行。 人工控制昼夜交替。,（3）微生物学寄生虫学等级和饲养环境,100,2. 染毒方式,尽量选择和人类接触途径相似的方式； 与预期进行的慢性毒作用研究的接触途 径相一致。 以经口、经呼吸道和经皮染毒为多。 染毒频率通常每日一次，连续给予，如 试验期为3个月以上，可每周6次。,101,（1）经口染毒途径：灌胃法、喂饲法、胶囊法。建议灌胃法，特别是要求染毒量准确性高。犬采用胶囊法或灌胃法。长期灌胃给药需熟练的技术和非常认真负责的工作态度，出现失误，均应如实记录，以利试验结果的准确评价。,102,（2）经呼吸道染毒的时间2-6h/d，设计需要可缩短或延长。工业毒物可缩短至1h，环境污染物可延长至8h （3）一些特殊染毒途径的亚慢性毒性试验，受目前技术条件的限制较难进行，常不能确保给药量的准确。如长期反复的直肠用药、眼睛用药等，期待研制出完善的专用装置。,103,（4）随着注射剂型的新药增多，需经常进行注射染毒长期毒性试验。犬静脉注射比较易行、常用。大鼠连续反复长期的静脉注射十分困难，有熟练的技术人员，也难以进行的。可用其他注射途径代替，如腹腔注射。尽管大鼠有较强的抗感染能力，但长期反复腹腔注射仍应注意无菌操作。,104,（5）在进行亚慢性毒性试验时，最好应结合进行毒代动力学血药浓度的监测。为了维持实验动物体液中有一个准确的血药浓度水平，保持受试物生物学效应每日相似性，亚慢性毒性试验每日染毒的时间应保持一致。在每日上午进行，给药后喂食。,105,3. 剂量选择和分组,设3个剂量组和1个阴性（溶剂）对照组。 高剂量组应能引起明显的毒性或少量动物的死亡（少于10%）。 低剂量组应无中毒反应，相当于未观察到有害作用剂量（NOAEL）。,106,3. 剂量选择和分组,高低剂量组间设置1个中剂量组，比较理想的中剂量组约相当于观察到有害作用的最低剂量（LOAEL）。 高、中、低剂量组距以3-10倍为宜，不少于2倍。 对于药物，大鼠可用人临床拟用剂量的10、30和100倍，非啮齿类可用5、15、50倍。,107,3. 剂量选择和分组,在实际工作中，由于受试物多样性和试验中多种因素的变化，亚慢性毒性试验的剂量设计和确定是很不容易的，需要具有丰富的毒理学经验。,108,4. 观察指标,对经外源化学物染毒后的实验动物进行全面、系统、深入的观察检测是亚慢性毒性试验必做的工作，检查的时间包括染毒前、试验过程中、染毒结束时和染毒结束后的恢复期做检查。检查的项目包括一般性指标、实验室指标、系统尸解和病理组织学检查、其他特殊指标检查。,亚慢性和慢性毒性试验检测各种毒性终点的流程图,亚慢性、慢性,毒性试验,过程中,外观,生长和发育,行为功能,毒性体征,生物体液,最终体重,脏器湿重,脏,/,体比,活杀解剖,器官/组织,大体尸解,固定/染色,显微镜检查,血液学,血清-化学-生化学,尿分析,生物学标志,酶,内源性成分,胆汁,尿,110,指外观体征和行为活动，粪便性状、食量及体重变化等，能综合反映毒物对机体的毒作用，是敏感的综合毒效应指标。在试验过程中，应详细记录，仔细分析，可以从中发现一些化学毒物的毒性特征。,（1）一般性指标,111,观察实验动物出现的外观体征和行为改变，记录各症状出现的时间和先后次序，包括食欲、活动、被毛、分泌物、排泄物、呼吸等，尤其要留意动物被毛的光洁度与色泽、眼分泌物、呼吸、神态、行为等。有助于分析化学毒物损害机体的部位及程度。,外观体征、行为活动,112,是一个敏感、客观的指标，反映了受试物对实验动物的生长发育及一般状态的影响。 如果受试组动物体重增长比对照组低10%，提示是由受试物引起的毒效应 如果各剂量组体重增长改变有剂量-反应关系，肯定是一种毒性效应。 每周称重一次，3个月后每2周称重一次。,动物体重,113,每月观察并记录动物的饲料消耗量，计算食物利用率，即动物每食入100g饲料所增长的体重克数（g体重/100g饲料）。比较各染毒组与对照组动物的食物利用率，有助于了解化学物的毒性效应，尤其将体重指标和食物利用率结合起来分析。,食物利用率,114,食物利用率,如果受试物影响食欲，则每日进食量减少，体重增长会受影响，但食物利用率不一定改变；如果受试物干扰了食物的吸收或代谢，虽然不一定影响食欲，但体重增长却减慢，因而食物利用率也会有所改变。,115,通常包括血、尿常规和血液生化指标检测。 目的是发现受试物所致器官损伤和功能紊乱，体内生化转化和排泄的重要器官肝和胃的功能是检查重点，血液是另一个重要的靶器官。,（2）实验室检查,116,血液学检查：红细胞计数、血红蛋白含量、白细胞计数及分类、血小板计数、凝血时间等。 尿液检查:外观、pH值、蛋白、糖、潜血和沉淀物镜检等，可提供与毒物有关的靶器官毒性和中间代谢产物的信息。,117,血清天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、碱性磷酸酶(ALP)、尿素氮(BUN0、总量白(TP)、白蛋白(ALB)、血糖(GLU)、总胆红素(T-BIL)、肌酐(Crea)、总胆固醇(T-CHO)等。,血液生化检查：,118,大鼠作试验，不需在给药前作实验室检查。 大动物犬等试验，染毒前检测12次。 恢复期试验，在结束时作实验室检查，对判断受试物作用的可逆性、延迟性有重要意义。,119,不影响实验动物生理功能的最大取血量为其总血量的10%。 总血量约为50ml/kg，0.3kg的大鼠约有15ml血液，一次取血量不应超过1.5ml。,120,试验结束时活杀实验动物，作系统解剖，进行详细的肉眼检查，测定脏器重量并作组织病理学检查。在试验中间死亡或处于濒死状态的动物，亦应作及时的系统尸解和病理学检查。,（3）系统尸解和病理组织学检查,121,脏器系数或称脏体比，指某个脏器的湿重与单位体重的比值，通常是每100g体重中某脏器所占的质量，表示为脏器质量（g）/体重（100g）。适用于实质性脏器，若某脏器的脏器系数增大或减小，反映该脏器的肿大或缩小，如增生、充血、水肿、萎缩等变化。,脏器重量和脏器系数,122,目的 是确定化学毒物对机体毒作用的靶部位、损害的性质和程度，从病理学角度寻找化学毒物与病理改变的剂量效应关系，为了解化学毒物的毒效应及其机制提供依据。,病理学检查,123,检查内容： 大体检查、常规病理组织学检查、酶组织化学检查、免疫组织化学检查、细胞超微结构检查等，分别从大体、组织、细胞、亚细胞甚至分子水平等多个方面发现化学毒物的毒效应。,病理学检查,124,根据受试物毒性资料、试验中的观察和受试物的结构等线索增加一些检查项目。 推测受试物可能对心血管系统有毒性，进行心电图、血压、眼底检测； 对神经系统有影响，进行神经行为、神经反射等检查；,（4）其他指标的检查,125,对电解质、微量元素代谢有毒作用，则检测血钙、血磷等含量； 增加眼科、骨髓象检查等。 增加酶组织化学检查、免疫组织化学检查和细胞超微结构检查等。,（4）其他指标的检查,126,为充分了解受试物的中毒特征，获得尽可能多的揭示毒性靶器官和中毒机理的线索，亚慢性毒性试验应认真仔细的选择观察指标，如能有特异性指标更好。,（4）其他指标的检查,127,特异性指标（生物学标志）是指能反映毒物对机体毒作用本质的特征性指标，常与其毒作用机制有关。确定特异性指标的难度较大。,（4）其他指标的检查,128,在仔细分析化学毒物的急性、亚急性毒性试验过程中动物中毒表现的基础上，结合受试物的化学结构和了解其特殊的化学基团找出线索，然后设计测试项目和方案。,129,三、 慢性毒性作用,慢性毒性(chronic toxicity)：指人和试验动物长期(甚至终生)反复接触低剂量化学毒物所产生的毒性效应。 “长期”，一般是指2年。大鼠相当于终生染毒，兔相当于生命期的36%，犬为20%，猴为13%。,130,1. 研究慢性毒性剂量-反应（效应）关系。确定长期接触造成有害作用的最低剂量(LOAEL)或阈剂量和造成有害作用的剂量(NOAEL)，为制定人类接触时的安全限量标准，如最高容许浓度(MAC)和每日容许摄入量(ADI)以及危险度评价提供毒理学依据。,慢性毒性试验目的,131,2. 观察慢性毒性效应谱、毒作用特 点和毒作用靶器官。 3. 观察慢性毒性作用的可逆性。 4. 为毒性机制研究和将毒性结果外 推到人提供依据。,慢性毒性试验目的,132,慢性毒性试验方法要点,与亚慢性相同。最好用纯系动物并将同窝动物均匀分配到各组。 啮齿类首选大鼠，非啮齿类为犬或猴。 每个剂量组的动物数应满足试验结束时数据统计学处理的要求，如每组大鼠4060只，狗810只，雌雄各半。,（一）实验动物的选择,133,应选择年龄较小的动物，一般选初断奶的大鼠或小鼠，即小鼠出生后3周（体重约1015g），大鼠出生34周（体重约5070g），狗46月龄。 试验结束时每个剂量组每性别的啮齿类动物数不少于10只，非啮齿类不少于4只。,（一）实验动物的选择,134,工业毒物染毒6个月或更长时间，环境毒物与食品则要求1年以上或2年。 多采用经口染毒。染毒5-6d/w。 根据需要可经皮肤染毒和经呼吸道染毒，长期呼吸道染毒需有良好的专用动式吸入染毒装置。染毒时间工业毒物吸入4-6h/d，环境污染物要求8h/d。,（二） 染毒时间和期限,135,以亚慢性毒性试验数据（阈剂量或最大无作用剂量）、人群期望接触剂量等为依据。理想的剂量选择应能体现：一种毒性物质的剂量-反应关系；最大无作用水平（NOAEL）；最高剂量组能观察到某些毒作用所致变化。,（三）剂量分组,136,设3个染毒剂量组和1个对照组，必要时设1个溶剂对照组。 以亚慢性毒性试验阈值LOAEL的1/5-1/2为其最高剂量组，以1/50-1/10为中间剂量组，以1/100为最低剂量组。,（三）剂量分组,137,以1/10LD50为最高剂量，以1/100 LD50为预期慢性阈剂量（中剂量），1/1000LD50为最大无作用剂量（低剂量）。 组间的剂量间距应大一些，一般以5-10倍为宜，最低不小于2倍。,（三）剂量分组,138,足够高的剂量以能观察到受试物的毒性作用，阐明毒性靶器官，试验能顺利进行； 有明确的剂量-反应关系，得到理想的LOAEL和NOAEL。,合理的剂量设置应能得到如下结果,139,检查一般性指标、实验室检查、病理学检查、其他及特异性指标。重点观察在亚慢性毒性试验中已经显现的阳性指标。优先采用亚慢性毒性试验筛选出来的敏感指标或特异性指标。病理组织学检查是非常重要的、必不可少的，常常是最客观和最有说服力的指标。,（四） 观察指标,140,试验前的一些观察指标作为自身前后对照的基础 染毒期间动态地观察各项指标，与对照组同步比较，消除年龄差的影响 对各项观察指标的检测严格实施质量控制 凡是在染毒期间死亡或染毒终止时出现肿物的动物，及时作病理检查。,实验过程需注意以下几点：,141,（四）慢性毒性试验的注意事项,1. 试验动物环境的要求 试验动物的饲养和试验环境规范化十分重要。大鼠慢性毒性试验必须应在符合国家实验动物标准的屏障环境中进行。保持试验动物屏障设施在二年多的试验期间一直稳定有效规范地工作，需有优良的设施和备用条件，有认真负责、工种齐全、技术精湛人员队伍。,142,（四）慢性毒性试验的注意事项,2. 检测条件的控制 慢性毒性试验在试验前、试验过程中和结束时要多次检测，要求检测仪器和辅助条件准确可靠，长期稳定可比。唯一的方法就是实施严格的质量控制。,143,（四）慢性毒性试验的注意事项,3. 重视试验前和对照组的检测，动态地、密切性观察检测试验全过程各项指标的变化。剔除个体差异过大的动物。染毒期间动态检测，根据毒性反应情况增加观察的频度和范围。试验过程中濒死或死亡动物，提前采集生物材料作检查。,144,亚慢性毒性评价包括三步： 1 明确化学物质的毒效应。 2 确定毒效应的敏感指标，并依据指标出现变化的情况来确定阈剂量和/或最大无作用剂量。 3 根据阈剂量和/或最大无作用剂量，进行评价。,亚慢性、慢性毒性作用评价,145,慢性毒性评价： 与亚慢性基本相同，根据毒作用的敏感指标，确定慢性阈剂量和/或最大无作用剂量以及慢性毒作用带，进行评价。,亚慢性、慢性毒性作用评价,Thank You !,147,思考题,如何设计急性毒性试验？ 如何设计亚慢性和慢性毒性试验？,