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第十部分 生物技术实践,第31讲微生物的利用,教材梳理,题型探究,大肠杆菌的培养和分离,1.细菌的培养 (1)培养基:扩大培养用培养基,划线分离用 培养基。 (2)不同微生物对培养基的需求,蛋白胨,氯化钠,中性偏碱,蔗糖,中性偏酸,LB液体,LB固体平面,教材梳理,题型探究,(3)培养的方法:需要将已有细菌的培养物转移到新的培养基中,一般用(工具)转移带菌的培养物。 2.细菌分离的方法与特点,3.无菌操作 (1)目的:防止实验室的培养物被其他污染;避免操作者自身被微生物感染。,微生物,接种环,划线分离,涂布分离,教材梳理,题型探究,高压蒸汽灭菌,尿素,碳化,500 g/cm2,酒精灯火焰,G6玻璃砂漏斗,(2)常用的几种灭菌方法,教材梳理,题型探究,30,6080,冷却,冷却,过热杀死目的菌种,HCl,抽滤去酸,中性,教材梳理,题型探究,4.大肠杆菌的培养和分离 (1)大肠杆菌 分裂方式:。 特性:大肠杆菌是革兰氏性、(代谢类型)的肠道杆菌,在肠道中一般对人无害,但若进入人的系统,就会对人体产生危害。大肠杆菌是技术中被广泛采用的工具。 (2)实验内容:将大肠杆菌扩大培养和划线分离,即用 培养基扩大培养大肠杆菌,培养后再在 培养基上划线进行分离,随后培养基上就会形成一个个单独的菌落。,二分裂,阴,兼性厌氧,泌尿,基因工程,LB液体,LB固体平面,教材梳理,题型探究,(3)实验步骤,倒平板,高压蒸汽,三角瓶,连续划线,教材梳理,题型探究,(4)大肠杆菌分离的用途:单菌落的分离是的通用方法,也是用于筛选菌株的最简便方法之一。,单菌落,斜面,4 冰箱,消除污染杂菌,高表达量,教材梳理,题型探究,考向一划线分离法和涂布分离法 【典例1-1】 如图是微生物平板划线示意图。划线的顺序为1、2、3、4、5。下列叙述正确的是() A.在五个区域中划线前后都要对接种环和培养基进行灭菌 B.划线操作时完全打开培养皿盖,划完立即盖上 C.接种时不能划破培养基,否则难以达到分离单菌落的目的 D.第1区和第5区的划线最终要连接起来,以便比较前后的菌落数,答案,解析,教材梳理,题型探究,【典例1-2】 用划线分离法或涂布分离法纯化大肠杆菌时() 可以用相同的培养基 都需要使用接种环进行接种 都需要在酒精灯火焰旁进行接种 都可以用来计数活菌 A.B. C.D.,答案,解析,教材梳理,题型探究,概念辨析微生物接种的两种常用方法比较,教材梳理,题型探究,考向二无菌操作 【典例1-3】 下列有关微生物培养的叙述中,不正确的是() A.获得纯净培养物的关键是防止杂菌污染 B.单菌落的分离是消除污染的杂菌的通用方法 C.培养基都必须使用高压蒸汽灭菌法灭菌 D.倒置平板防止培养皿盖上的冷凝水滴落,答案,解析,教材梳理,题型探究,【典例1-4】 (2018浙江选考十校联盟3月适应性考试)回答下列与微生物的培养和利用有关的问题。 (1)微生物在试管中培养时通常加棉塞,周围没有皱褶和缝隙,容易拔出,但用手提着棉塞时,试管又不能落下。棉塞的作用有两个:一是;二是保证通气良好。制作棉塞所用的棉花不能用脱脂棉,原因是。 (2)测定微生物生长曲线的方法有很多,有血细胞计数板法、平板 计数法、法等。制作生长曲线时,以 作纵坐标,作横坐标。 (3)牛肉膏蛋白胨培养基是一种应用最广泛和最普通的细菌基础培养基,一般要将pH调至,以利于细菌的生长繁殖。,教材梳理,题型探究,答案:(1)防止杂菌污染脱脂棉易吸水,吸水后容易引起污染(2)菌落比浊菌数的对数生长时间(3)中性偏碱 解析:(1)微生物培养过程中棉塞既可以防止杂菌的污染,又可以保证通气良好。因为脱脂棉易吸水,吸水后容易引起污染,所以制作棉塞所用的棉花不能用脱脂棉。 (2)测定微生物生长曲线的方法有很多,有血细胞计数板法、平板菌落计数法、比浊法等。制作生长曲线时,应以菌数的对数为纵坐标,生长时间为横坐标。 (3)培养一般细菌时,需要将培养基的pH调至中性偏碱。,教材梳理,题型探究,概念辨析消毒与灭菌,教材梳理,题型探究,考向三大肠杆菌的培养和分离 【典例1-5】 (2018浙江丽水学院附中阶段考)下列是有关大肠杆菌的培养实验,请回答问题。 (1)配制培养大肠杆菌的培养基时,根据“细菌喜荤,霉菌喜素”的规律,通常在培养基中加入蛋白胨和作为营养物质,为维持一定的渗透压,常需加入一定量的。,教材梳理,题型探究,(2)大肠杆菌培养和分离的实验中,在中进行扩大培养,培养液经后,在LB固体培养基上进行,并将培养皿放在恒温培养箱中培养,可以获得如图效果。为了检测接种、培养过程是否受杂菌污染以及,应同时将未接种的培养基放入相同条件的恒温培养箱培养。 (3)对获得的纯菌种通常可以依据的形状、大小等特征进行初步的鉴定。,教材梳理,题型探究,(4)下列关于“大肠杆菌培养和分离”的操作中,叙述正确的是() A.高压灭菌加热结束时,打开放气阀使压力表指针回到零后,开启锅盖 B.倒平板时,应将打开的皿盖放到一边,以免培养基溅到皿盖上 C.为了防止污染,接种工具经火焰灭菌后应趁热快速挑取菌落 D.用记号笔标记培养皿中菌落时,应标记在皿底上,答案:(1)酵母提取物NaCl(2)LB液体培养基稀释分离倒置无菌操作是否规范(3)菌落(4)D,教材梳理,题型探究,解析:(1)配制培养大肠杆菌的培养基时,根据“细菌喜荤,霉菌喜素”的规律,通常在培养基中加入蛋白胨和酵母提取物作为营养物质,为维持一定的渗透压,常需加入一定量的NaCl。(2)大肠杆菌培养和分离的实验中,在LB液体培养基中进行扩大培养,培养液经稀释后,在LB固体培养基上进行分离,并将培养皿倒置放在恒温培养箱中培养;为了检测接种、培养过程是否受杂菌污染以及无菌操作是否规范,应同时将未接种的培养基放入恒温培养箱培养。(3)通常对获得的纯菌种可以依据菌落的形状、大小等特征进行初步的鉴定。(4)高压灭菌加热结束,等待压力表指针回到零后,才能开启锅盖,不能直接打开放气阀使压力表指针回到零,A项错误;倒平板过程中不能打开培养皿的皿盖,以防止杂菌污染,B项错误;接种环在火焰上灼烧后,待冷却后才可以快速挑取菌落,C项错误;用记号笔标记培养皿中菌落时,应标记在皿底上,D项正确。,教材梳理,题型探究,易错提醒(1)恒温培养时,培养基中的水分会以水蒸气的形式蒸发,倒放培养皿则会使水蒸气凝结成水滴留在盖上;如果正放培养皿,则水分形成的水滴会落入培养基表面并且扩散开。如果培养皿中已形成菌落,则菌落中的菌会随水扩散,菌落间相互影响,很难再分成单菌落,达不到分离的目的。因此恒温培养时,培养皿必须倒置。 (2)平板划线时除第一次划线外,每一次划线的起点都是上一次划线的末端,而不是第一次划线的末端。,教材梳理,题型探究,真题演练,分离以尿素为氮源的微生物 1.菌种特点 含有酶,可通过降解尿素作为其生长的氮源。 2.培养基:以为唯一氮源的培养基,以 为对照。 3.实验原理 (1)筛选以尿素为氮源的微生物,可使用以尿素为唯一氮源的 培养基进行选择培养。 (2)脲酶能将尿素分解成,致使培养基的pH升高,使培养基中的酚红由红黄色变成色。,脲,尿素,LB全营养培养基,选择,NH3,红,教材梳理,题型探究,真题演练,4.实验步骤,1,无菌,10-2,悬液,0.1,LB培养基,倒置,较多的,少量,教材梳理,题型探究,真题演练,考向一分离以尿素为氮源的微生物 【典例2-1】 下图是“分离以尿素为氮源的微生物”实验的基本流程,请回答下列问题。,(1)尿素溶液可用使之无菌。若要检查B过程灭菌是否彻底,可以采用的方法是。 (2)图中步骤C为。相对于划线分离法,过程D涂布分离法的优点是。 (3)如果菌落周围出现色环带,说明该菌落能分泌脲酶。,教材梳理,题型探究,真题演练,答案:(1)G6玻璃砂漏斗过滤将空白培养基放在适宜温度下培养一段时间,观察有无菌落出现(2)倒平板单菌落更易分开(3)红 解析:(1)尿素用G6玻璃砂漏斗过滤除去其中的细菌等微生物。(3)若菌落能分泌脲酶,则菌落周围会出现红色环带。,教材梳理,题型探究,真题演练,疑难解析1.培养基中观测指标的分析 (1)培养基中的酚红指示剂产生颜色变化(变红),标志着存在脲酶水解尿素的作用,从而证明这一菌株能以尿素为氮源。红色环状区域的大小代表脲酶活性的强弱和含量的多少。红色区域越大,表明菌株利用尿素的能力越强。 (2)与全营养培养基上的菌落数比较,尿素培养基上只有少数菌落,这一现象表明能利用尿素的细菌在土壤菌群中只占极少部分。 2.样品稀释的原因和标准 (1)稀释原因:样品的稀释度直接影响平板上生长的菌落数。在适当的稀释度下,培养基表面生长的一个菌落,来源于样品稀释液中的一个活菌。因此,恰当的稀释度是成功地统计菌落数的关键。 (2)稀释标准:选用一定范围的样品稀释液进行培养,为了保证结果准确,一般选择菌落数在30300的平板计数。,教材梳理,题型探究,真题演练,考向二实验应用 【典例2-2】 (2018浙江宁波3月新高考模拟)研究小组从土壤中筛选以多环芳烃(PAHs)为碳源和能源的细菌,用以降解工业废水和生活污水中的PAHs。请回答下列问题。 (1)为了从土壤中筛选PAHs降解菌,需配制以为唯一碳源的培养基,培养基经A.121 (500 g/cm2压力),15 minB.90 (500 g/cm2压力),15 min C.121 (1 kg/cm2压力),15 minD.90 (500 g/cm2压力),30 min高压蒸汽灭菌,待冷却至60 后倒平板。 (2)倒平板时应使锥形瓶的瓶口通过火焰,目的是。在倒平板的过程中,如果培养基溅在皿盖与皿底之间的部位,则这个平板不能用来培养PAHs降解菌,原因是。,教材梳理,题型探究,真题演练,(3)制备土壤稀释液,用方法接种于固体培养基表面,培养时,需将培养皿并放在37 恒温培养箱中培养24 h。 (4)用划线法纯化PAHs降解菌的过程中,在第二次及其后的划线操作时,须从上一次划线的末端开始划线,原因是。,答案:(1)PAHsC(2)防止杂菌污染空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生(3)涂布倒置(4)使细菌数随着划线次数的增加而逐渐减少,最终得到由单个细菌繁殖而成的菌落,教材梳理,题型探究,真题演练,解析:(1)从土壤中筛选PAHs降解菌,需配制以PAHs为唯一碳源的培养基,培养基经121 (1 kg/cm2压力)、15 min的高压蒸汽灭菌,待冷却至60 后倒平板。 (2)倒平板时,为了防止杂菌污染,应使锥形瓶的瓶口通过火焰。在倒平板的过程中,如果培养基溅在皿盖与皿底之间的部位,则可能导致空气中的微生物在皿盖与皿底之间的培养基上滋生,因此这个平板不能用来培养PAHs降解菌。 (3)制备土壤稀释液,用涂布方法接种于固体培养基表面。培养时,为了防止培养皿被污染,需将培养皿倒置并放在37 恒温培养箱中培养24 h。 (4)用划线法纯化PAHs降解菌的过程中,在第二次及其后的划线操作时,须从上一次划线的末端开始划线,原因是:使细菌数随着划线次数的增加而逐渐减少,最终得到由单个细菌繁殖而成的菌落。,教材梳理,题型探究,真题演练,导师点睛微生物筛选过程中必要的两种对照培养基及其作用,教材梳理,题型探究,真题演练,(2016浙江10月选考,32节选)请回答从土壤中分离产脲酶细菌和脲酶固定化实验的有关问题。 (1)LB固体培养基:取适量蛋白胨、酵母提取物、NaCl,加入一定量的蒸馏水溶解,再加,灭菌备用。 (2)尿素固体培养基:先将适宜浓度的尿素溶液用灭菌过的 G6玻璃砂漏斗过滤,G6玻璃砂漏斗因为,故用于过滤除菌。然后将尿素溶液加入已经灭菌的含有酚红的培养基中,备用。,教材梳理,题型探究,真题演练,(3)取适量含产脲酶细菌的10-4、10-5两种土壤稀释液,分别涂布接种到LB固体培养基和尿素固体培养基上,培养48 h,推测固体培养基上菌落数最少的是(A.10-5稀释液+尿素固体培养基B.10-5稀释液+LB固体培养基C.10-4稀释液+尿素固体培养基D.10-4稀释液+LB固体培养基)。在尿素固体培养基上产生脲酶细菌菌落周围出现,其原因是细菌产生的脲酶催化尿素分解产生 所致。 (4)制备固定化脲酶时,用石英砂吸附脲酶,装柱。再用蒸馏水洗涤固定化酶柱,其作用是。,答案:(1)琼脂(2)高压蒸汽孔径小,细菌不能滤过(3)A红色环氨(或NH3)(4)除去游离的脲酶,教材梳理,题型探究,真题演练,解析:(1)在从土壤中分离产脲酶细菌实验中,制备LB固体培养基时应加适量的蛋白胨、酵母提取物、NaCl、蒸馏水和琼脂。(2)制尿素固体培养基时,先将适宜浓度的尿素溶液用高压蒸汽灭菌过的 G6玻璃砂漏斗过滤除菌,因为G6玻璃砂漏斗孔径小,细菌不能滤过,然后将尿素溶液加入已经灭菌的含有酚红的培养基中即可。(3)10-4、10-5两种土壤稀释液分别涂布接种到LB固体培养基和尿素固体培养基上,培养48 h,固体培养基上菌落数最少的是10-5稀释液+尿素固体培养基,因为此组不但土壤溶液浓度低,而且由于自然界中能利用尿素的细菌在土壤中只占少数,故培养基中以尿素为唯一氮源的固体培养基中的菌落最少,A项正确。因是细菌产生的脲酶催化尿素分解产生碱性的氨,故尿素固体培养基上产生脲酶细菌菌落周围出现红色环带。(4)制备固定化脲酶柱时要用蒸馏水洗涤固定化酶柱,以除去游离(未固定)的脲酶。,
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