缓冲液与稀释液

缓冲液缓冲液是一种能在加入少量酸或碱时抵抗pH改变的溶液。PH缓冲系统对维持生物的正常pH值，正常生理环境起重要作用。多数细胞仅能在很窄的pH范围内进行活动，而且需要有缓冲体系来抵抗在代谢过程中出现的pH变化。在生物体中有三种主要的pH缓冲体系，它们时蛋白质、重碳酸盐缓冲体系。每种缓冲体系所占的分量在各类细胞和器官中是不同的。在生化研究工作中，常常要用到缓冲溶液来维持实验体系的酸碱度。研究工作的溶液体系pH值的变化往往直接影响到我们工作的成效。如果提取酶实验体系的pH值变化或变化过大，会使酶活性下降甚至完全失活。所以我们要学会配制缓冲溶液。由弱酸及其盐组合一起使具有缓冲作用。生化实验室常常用的缓冲系主要有磷酸、柠檬酸、碳酸、醋酸、巴比妥酸、Tiris（三羟甲基氨基甲烷）等系统，在生化实验或研究工作中要慎重地选择缓冲体系，因为有时影响实验结果的因素并不是缓冲液的pH值，而是缓冲液中的某种离子。如硼酸盐、柠檬酸盐、磷酸盐和三羟甲基甲烷等缓冲剂都可能产生不需要的反应。硼酸盐：硼酸盐与许多化合物形成复盐、如蔗糖。柠檬酸盐：柠檬酸盐离子容易与钙结合，所以存在有钙离子的情况下不能使用。磷酸盐：在有些实验，它是酶的抑止剂或甚至是一个代谢物，重金属易以磷酸盐的形式从溶液中沉淀出来。而且它在pH7.5以上时缓冲能力很小。三羟甲基氨基甲烷：它可以和重金属一起作用，但在有些系统中也起抑止的作用。其主要缺点时温度效应。这点往往被忽视，在室温pH是7.8的Tris一缓冲液，在4时是8.4，在37时是7.4，因此，4配制的缓冲液拿到37测量时，其氢离子浓度就增加了10倍。而且它在pH7.5以下，缓冲能力很差。缓冲液的pH值由哪些因素决定？设缓冲系统的弱酸的电离常数为K（平衡常数），平衡时弱酸的浓度为酸，弱酸盐的浓度为盐，则由弱酸的电离平衡式可得下式：根据此式可得出下列几点结论：（1）缓冲液的pH值与该酸的电离平衡常数K及盐和酸的浓度有关。弱酸一定，但酸和盐的比例不同时，可以得到不同的pH值。当酸和盐浓度相等时，溶液的pH值与PK值相同。（2）酸和盐浓度等比例也增减时，溶液的pH值不便。（3）酸和盐浓度相等时，缓冲液的缓冲效率为最高，比例相差越大，缓冲效率越低，一般地说缓冲液有效缓冲范围为PK1pH。从上述可知，只要知道缓冲对的PK值，和要配制的缓冲液的pH值（及要求的缓冲液总浓度）时，可按公式计算出盐和酸的量。这样算涉及到对数的换算，较麻烦，前人为减少后人的计算麻烦，经计算已为我们总结出pH值与缓冲液对离子用量的关系列出了表格。讲义附录部分节录有磷酸缓冲液的配制表。只要我们知道要配制的缓冲液的pH，经查表便可计算处所用缓冲剂的比例和用量。例如配制500nmpH5.8浓度为0.1M磷酸缓冲液。经查表知pH5.8浓度为0.2M Na2HPO48.0毫升，而0.2M Na2HPO492.0毫升。依此可推论出配制100ml0.1M的磷酸缓冲液需要0.1M Na2HPO48.0毫升，而0.1M Na2HPO4需要92.0毫升。所以500ml 0.1M磷酸缓冲液需要Na2HPO4量为:需Na2HPO4量为 :计算好后，按计算结果称好药品，放于烧杯中，加少量蒸馏水溶解，转移入50ml容量瓶，加蒸馏水至刻度，摇匀，便得所需的缓冲液。各种缓冲溶液的配制，均按下表按比例混合，某些试剂，必须标定配成准确的浓度才能进行，如醋酸、NaOH等。（1）醋酸盐缓冲溶液PHM/S醋酸钠(毫升数)M/S醋酸(毫升数)PHM/S醋酸钠(毫升数)M/S醋酸(毫升数)PHM/S醋酸钠(毫升数)M/S醋酸(毫升数)3.21323.41164.49.412.65.417.12.93.61.518.54.69.810.25.618.11.93.82.417.64.812.08.05.91914.03.616.45.014.15.96.219.90.14.25.314.75.215.84.2（2）磷酸盐缓冲液的配制1/15M的Na2HPO4溶液（11.876克纯的Na2HPO42H2O溶于1升蒸馏水中）及1/15M的KH2PO4溶液（将9.078克KH2PO4溶于1升水中）将着两种溶液依不同比例混合。PHNa2HPO4（ml）KH2PO4（ml）PHNa2HPO4（ml）KH2PO4（ml）PHNa2HPO4（ml）KH2PO4（ml）4.940.19.906.464.006.007.739.001.005.290.259.756.815.005.008.049.500.505.390.509.506.986.004.008.349.750.255.911.009.007.177.003.008.699.900.106.242.008.007.388.002.009.1810.000.006.473.007.00(3)Tris缓冲溶液贮备液溶液A：0.2M Tris（三羟甲基氨基甲烷）溶液B：0.2M HCl50mlAXmlB，用蒸馏水稀释到200mlpHX（ml）pHX（ml）7.244.28.221.97.441.48.416.57.638.48.612.27.832.58.88.18.026.89.05.0（4）磷酸盐柠檬酸缓冲液的配制0.2M Na2HPO42H2O溶液及0.1M柠檬酸溶液，并依不同比例混合（见表）pHNa2HPO4（ml）柠檬酸（ml）pHNa2HPO4（ml）柠檬酸（ml）2.20.4019.605.210.729.282.41.1413.765.411.158.852.62.1817.825.611.608.402.83.1716.835.812.097.913.04.1115.896.012.637.373.21.9415.066.213.226.783.45.7014.306.413.856.153.66.4413.566.614.555.453.87.1012.906.815.454.554.07.7112.297.016.473.534.28.2811.787.217.392.614.48.8211.187.418.171.834.69.3510.857.618.731.274.89.8610.147.819.150.855.00.309.708.019.450.55(5)盐缓冲液的配制a、M/20硼砂（10.108克Na2B4O710H2O溶在一升水中）b、M/5硼酸M/20NaCl（12.45克H2BO2.925克）NaCl在一升水中（见下表）pHa(ml)b(ml)pHa(ml)b(ml)7.00.459.558.23.56.57.20.759.258.44.455.557.31.108.98.65.54.57.82.057.959.08.21.88.02.707.3(五)药品规格及其应用范围根据药品纯度不同一般可分为下列几类：（1）保证试剂 （G、R）用在科学研究及微量分析方面（2）分析试剂 （A、R）定量分析时标定溶液用（3）化学纯试剂（C、P）定性试验时用（4）实验试剂 （L、R）用于和实验结果关系不大的场合（5）工业品 用于大型或工业生产上在实验中用的最多的是C、P一类，A、R使用较少，G、R非有特殊需要时，一般尽量用A、R来代替，因为纯度高，价格很贵。除上述几种规格外尚有几种不以纯度分类的规格：（1）生物试剂 （B、R）生物体中提炼出来，成分含量相差较大，如培养微生物时用牛肉膏，酵母膏等药品即属此类。（2）指示剂（Ind）配制指示剂用（3）层析纯，色层分析时采用（4）生物染色剂BS如甲基兰（6）常用标准溶液的配制与标定(1)0.1mol/L NaOH溶液1、配制方法：1）氢氧化钠中含有碳酸钠，所以不能直接配成纯溶液，因碳酸钠几乎不溶于饱和的氢氧化钠溶液中，故可以先配成饱和的氢氧化钠溶液（约19mol/L）而将沉淀弃去。另一个方法可加氯化钡110克溶于100ml水中配成饱和溶液，入瓶内密闭瓶塞，放置12天，使碳酸钠沉淀，取上层清夜6.3ml加入刚煮沸过冷却的蒸馏水750ml，可得浓度约为0.1N氢氧化钠溶液。2）称氢氧化钠结晶5克（或干燥棒状，或小片状得氢氧化钠5克）置于4000ml烧杯中，加水300ml，使之溶解，加热并缓缓加入1mol/L氯化钡溶液200ml。将碳酸钡沉淀后，将上层溶液倾入1000ml量筒中，加入刚煮沸冷却的蒸馏水，稀释至1000ml刻度处，放置使沉淀下沉，取其上清液。NaCO3BaCl2BaCO32NaCl2、标定取分析纯的苯二酸氢钾（KHC8H4O4）置于称量瓶中，于烘箱内105110下加热2小时，取出后放入干燥器内半小时，用倾出法在天平上称出约0.45克，称准至小数点第四位，共称两份，分别放入150ml三角瓶中，各加入25ml溶解后再加入1酚酞指示剂34滴，然后配制好的氢氧化钠溶液装入滴管中，滴定上述两种样品，其误差不得超过0.3，否则重行标定，氢氧化钠浓度计算如下式中：W邻苯二酸氢钠称取邻苯二酸钾的重量（克）VNaOH滴定用去氢氧化钠毫升数0.20442邻苯二酸氢钾的毫克当量。（2）0.1mol/L硫代硫酸钠溶液：1、配制方法：称取硫代硫酸钠（Na2S2O35H2O）12.5克无水碳酸钠0.2克溶于煮沸后冷却的水中稀释到1000毫升，其浓度约为0.1mol/L，放置34天后才能进行标定。2、标定：取分析纯的碘酸钾置称量瓶中于烘箱中加热105110两小时，移入干燥器内冷却，称出两份样品重量为0.070.08克（标准至小数四位）于250ml三角瓶中，各溶于50ml水中，待完全溶解后，各加入30碘化钾溶液10ml，12mol/L硫酸10ml，放置3分钟，稀释至150ml，用上述配制的硫代硫酸钠溶液滴定至草黄色，加入1淀粉指示剂5ml继续滴定至兰色消失，记录硫代硫酸钠溶液的用量。另取30碘化钾溶液10ml，12mol/L硫酸10ml，加水至150ml加入淀粉指示剂5ml，用硫代硫酸钠滴定，作为空白试验：硫代硫酸钠溶液计算如下：WKIO3称取碘酸钾的重量（克）VNa2S2O3滴定用去硫酸钠溶液的毫升数VNa2S2O3空白实验用去硫代硫酸钠溶液的毫升数。214.2KIO3的克分子量6KIO3的当量注：硫代硫酸钠溶液易被空气氧化，如溶液中有硫细菌时，也能使硫代硫酸钠分解，而光线使硫细菌生长，此外硫代硫酸钠亦能与CO2作用，所以此溶液在放置过程中浓度逐渐降低，所以此溶液应放置在棕色瓶中密闭瓶塞。所以每隔一定时间应重新标定一次。如发现溶液浑浊（析出硫磺）就不能再用。（3）0.1mol/L高锰酸钾溶液1、制备方法：称取分析纯高锰酸钾3.2克入1000ml烧杯中，加400ml水加热溶解，然后稀释至一升，静置一周以上，用玻璃制成的虹吸管，吸取上层清液贮于棕色细口瓶中。如为了缩短时间亦可用制备的溶液在接近沸腾温度下加热一小时，然后旋转过夜，次日用布氏漏斗或沙芯漏斗过滤。2、标定：称取分析纯草酸钠入称量瓶中，于烘箱中加热1501小时，然后正确称出0.250.30克两份于2个400ml烧杯中各加水100ml及12mol/L H2SO420ml，使之溶解，并加热至80，然后用高锰酸钾滴定，开始时滴定速度不宜过快，只能滴几滴，搅拌均匀待红色退去后，再以每分钟2025滴速度进行滴定，直至溶液呈粉红色，数分钟不退为止，滴定后溶液温度不宜低于60。（4）0.2mol/L碘液1、制备方法：碘在水中溶解度很小，不可能达到0.2mol/L，当溶液中有碘化钾存在时，碘和碘离子结合称为溶解度较大的才行。称取碘6.5克于500ml烧杯中加入13克碘化钾及水15ml（水不可多加，否则碘不能溶解完全），不时搅拌待碘完全溶解后，加水稀释至500ml，移入棕色瓶中，密闭塞紧置于阴暗处34天后再行标定。2、标定：准确称出在105110烘二小时的分析纯亚砷酸（AS2O2）0.200克（小心，有剧毒）两份于250ml三角瓶中，各加入6mol/L氢氧化钠5ml及水10ml，溶解后，再加6mol/L盐酸，用水稀释至总体积为100ml，再加入碳酸氢钠中和多余的酸，加1淀粉指示剂5ml，然后用碘液滴定，其浓度计算如下：WAS2O2称取亚砷酸的重量（克）VI2滴定用去碘液毫升数0.04946亚砷酸的毫克当量稀释液定义：顾名思义就是我们所需的纯溶液加水（或其他溶剂）而降低浓度后得到的溶液，注意：是混合物！在日常的实际实验操作中，我们往往不需要纯溶液进行实验，因此采用加水稀释的方式来得到浓度较低的溶液，从而更好的实验。综上所述：凡是通过增加溶剂来降低浓度的方法所得到的溶液都是稀释液！2稀释液的作用编辑1，阻止血液过快凝固血液暴露在空气中会凝固，当我们将血液滴入试纸采集区时，由于毛细效应，血液会向试纸的检测区扩散，但这需要一点时间，如果血液凝固过快，可能造成血液未扩散到检测区，就已经凝固，导致检测失败。另一方面，血浆中微凝血块过多，会减慢扩散的速度，检测结果产生的时间就会延长。2，稀释血液浓度加入稀释液后，血液的浓度会降低，HIV抗体的浓度也随之降低，这就为试纸的灵敏度提出了更高的要求，需要试纸能够检测出低浓度的HIV抗体，也正因此，当检测结果为阳性时，那么结果是非常准确的。但是，如果加入的稀释液过多，HIV抗体浓度太低，可能会导致试纸检测不出来，出现假阴性的情况。