纳米界面生物分子作用机制的基础研究及其在前列腺癌早期检测中的应用

项目名称：纳米界面生物分子作用机制的基础研究及其在前列腺癌早期检测中的应用首席科学家：樊春海 中国科学院上海应用物理研究所起止年限：2012.1至2016.8依托部门：上海市科委 中国科学院一、关键科学问题及研究内容本项目拟解决的关键科学问题如下：（1）如何设计生物传感界面并揭示纳米界面上生物分子作用机制 生物检测的关键步骤之一是在界面上通过抗体、DNA等识别分子实现对靶标分子的捕获。这一过程中涉及多种分子在纳米界面上的协同作用，在这个界面生物分子识别的效率是实现高灵敏生物检测的基础。一方面，生物分子在常规界面上容易产生非特异性吸附，这往往是影响生物传感器性能的重要因素和假阳性的重要来源，因此，如何通过合理设计纳米结构来构筑高特异性和高效生物反应的界面并实现生物识别分子的精确组装是本项目成功的关键。另一方面，组装在纳米材料界面上的生物分子需要保持其生理活性以充分发挥其功能（如特异性高效识别），因此生物分子在纳米界面的可控高效率偶联也是纳米生物检测技术中的一个关键问题。 我们将研究生物传感过程中的电荷转移、能量转移以及电子耦合机制，通过自组装参数的改变，揭示界面生物分子组装的机理及生物传感检测性能之间的关系并在此基础上实现优化。而通过界面亲疏水性和电荷密度及其分布的调控以及导入外力场的作用将有可能实现防止蛋白质非特异性吸附，可以在不同体液介质中通用的纳米界面。（2）如何实现生物检测中的有效信号转换及放大过程的光、电调控 生物检测的基本原理是将分子识别的行为（如抗体-抗原的结合）转化为各种物理或化学信号，该信号可以被传送到某一检测技术的信号收集平台，并通过各种相应的物理化学过程将信号进一步放大以提高检测灵敏度。由于生物分子对环境因子非常敏感，不同分子发挥其最佳功能所需要的环境条件是不一样的，而在信号级联放大过程中又需要将若干分子集成在一起，且在相同环境条件下发挥作用。因此，如何有效实现纳米生物检测中信号的高效、可靠、可重复的转换，并将信号有效地放大是提高生物传感器的检测可靠性、准确性与灵敏度的关键。针对这一问题，我们将设计与合成生物分子相容性好的纳米材料，并通过系统研究多种纳米材料和纳米结构的制备与修饰方法，实现纳米材料的生长尺寸和粒径分布的精确控制，并通过化学和物理方法对其进行剪裁、修饰、分散以及表面改性。通过考虑热力学和动力学因素，在实验中选择合适的生物分子组合，实现纳米材料与生物分子耦合，形成稳定、均一和高效的纳米生物探针用于生物检测信号的放大。同时通过调节环境因子（如pH，离子强度等）使得不同生物分子发挥最佳的协同作用。（3）如何通过肿瘤标志物联合检测来提高前列腺癌检测的特异性 临床医学研究表明，由于癌症成因和发生、发展的复杂性，通过单一靶标分子的检测来实现癌症的确诊几乎是不可能的；同时，各个已被发现的肿瘤分子标志物与肿瘤发生之间的关联性各有不同，目前也缺乏统一的标准和定论。因此，如何充分发掘已经发现的肿瘤相关的靶标分子的潜力，通过多个分子水平的多指标联合检测，将得到的大量数据建模分析，有望能对各个肿瘤标志物与特定癌症发生发展过程之间的响应性和相关性进行研究评价，并在此基础上通过多指标联合检测将提升早期检测的准确度，有效降低现有单一检测中假阳性与假阴性率过高的问题。 对于前列腺癌，我们将以成熟的PSA检测为基础，通过跨越蛋白质、DNA、RNA和小分子代谢物等四个分子水平的多环节、多指标联合检测来判断这些标志物对于判断前列腺癌发生和发展的响应性以及多个标志物之间的相互关联情况。同时，我们将通过多指标的数据分析建立一套前列腺癌早期检测的新方法，提高基于PSA筛查的前列腺癌诊断准确性，降低假阳性与假阴性概率，既不漏查假阴性病人，也可最大限度地使假阳性患者避免穿刺活检的痛苦。围绕以上关键科学问题本项目将进行以下研究：1. 界面纳米结构的构筑与生物分子作用机制的基础研究 系统研究蛋白质、核酸等生物大分子在纳米粒子界面上（纳米探针界面）和界面纳米结构上（传感界面）进行组装的过程中的物理化学特性，深入了解生物分子界面组装和识别过程及其机制，从而为提高生物检测的灵敏度、选择性、稳定性和响应速度等主要性能指标提供指导。 1.1 纳米探针界面与传感界面纳米结构的设计与合成 合成一系列高质量的功能纳米材料，并实现其可控生长和粒径可调；在金、碳或硅基底表面构筑精细纳米结构，并建立一套简便、重复性好的界面纳米结构构筑的工艺流程。通过表面修饰与改性，赋予这些纳米界面良好的水溶性、化学稳定性与生物相容性。1.2 纳米界面上生物分子的理化机制研究 从空间、能量、时间三个方面来对生物分子在纳米界面上的时空行为和动态结构进行高分辨、高灵敏表征，并进一步通过对特定分子功能团进行选择性剪裁和修饰，实现对纳米界面上生物分子的结构和功能的调控。通过利用光、电、磁外场的影响，研究该纳米生物体系中的结构变化、电子电荷输运、光电转换的问题以及相关的运作原理。 通过对生物分子在纳米界面上的固定化（组装）过程、分子识别过程、稳定性和可再生性的系统研究，形成对生物传感界面的完整认识并探索出一套系统、可行的组装方法，并获得纳米界面上的扩散、对流和生物反应的基本图景。1.3 多元、协同纳米界面的构筑 在深入理解界面生物分子作用机制的基础上，通过化学键合或分子自组装技术实现生物识别分子（如抗体、DNA、核酸适配体等）在纳米探针界面上的偶联，以设计具有选择性识别特定分子靶标的能力的纳米生物探针。 通过精确控制多种生物分子在其表面不同区域的组装，设计并构筑一个在局域空间内可协同发挥多功能的多元、协同纳米界面。在这一界面上，通过亲疏水性和电荷密度的调控防止杂质吸附和背景干扰，以实现靶标分子的高特异性捕获与识别；通过纳米材料的光电效应将生物识别过程有效转换成光或电信号，并纳米结构表面的级联放大实现信号倍增以提高检测灵敏度。2. 基于多元、协同界面的电化学纳米生物传感器研究 设计并制备具有多元、协同传感界面的电化学电极，提高电化学传感器的灵敏度与特异性，发展手持式的便携、灵敏、快速、廉价的电化学纳米生物传感装臵，实现对PSA的快速灵敏检测，用以满足前列腺癌大规模低成本筛查及前列腺癌术后的预后评价与监测的要求。 2.1设计电化学电极的多元协同传感界面，制备PSA抗原响应性电极 利用生物识别原理，综合运用各种技术如自组装、原位沉积、物理插入、化学修饰及电化学处理等传感界面固定化方法，在电极和电极阵列界面上构建纳米结构。通过，将特异性捕获探针（对PSA特异性识别的抗体或抗体片段）组装在具生物相容性的纳米界面上，制备对PSA抗原有特异性响应的生物敏感膜修饰电极。研究多元协同纳米界面的设计与优化，通过测定探针分子的负载量、空间取向与识别量的关系等来标定界面特性及修饰效果。纳米结构有助于使捕获探针保持高效的配体识别性能，并提高其稳定性。2.2研制基于电化学传感技术的PSA检测平台 利用生物识别原理和光、电、磁等对界面行为的影响，发展基于能量转移的新原理和信号传导与放大的新方法，实现生物识别信号的放大以增加信噪比，提高灵敏度。采用微电子光刻和化学镀等技术，设计与制备各种类型的阵列式传感基片，并设计相应配套的微流体通道及检测装臵，提供集成式的阵列微流体传感分析系统。研制能够自动过滤干扰物质的样品检测传感探头与传感器的信号检测与数据分析模块，构建针对PSA标志物的集成化和程序化的微芯片电化学传感检测平台。 2.3电化学纳米生物传感器的综合评价 通过调试以及样品测试条件的选择使电化学纳米生物传感器的综合性能指标误差控制在合理范围以内。将该传感器初步应用于血清及唾液、尿液和前列腺液等其它体液样本中的PSA检测，通过对灵敏度、特异性、准确度、稳定性、相关性等生物检测技术指标的分析，综合评价所构建的多通道便携式电化学生物传感平台在多种复杂生物体系中的功能，验证其在实际生物体系探测中的实用价值。3基于多元、协同界面的前列腺癌标志物的纳米生物检测方法研究 建立基于时间分辨荧光和共轭高分子探针的检测系统，发展针对PSA及其它新型蛋白靶标、基因水平的甲基化靶标、microRNA靶标和小分子代谢物靶标等四个水平的多种指标的生物分析方法，为利用多指标联合检测来有效降低PSA筛查中的假阳性率提供技术平台。 3.1 建立基于时间分辨荧光检测的蛋白质和小分子检测系统 建立及优化基于时间分辨荧光技术的检测平台。通过多元协同界面纳米提高抗体探针在界面的识别捕获效率，并利用课题一设计的稀土（Eu)纳米信号探针激发产生高强度的时间分辨荧光，从而显著提高靶标的检测灵敏度。3.2 建立基于核酸扩增和水溶性共轭聚合物信号放大的核酸检测系统 利用水溶性共轭聚合物纳米探针的高效荧光信号放大作用，将核酸扩增、荧光共振能量转移（FRET）相结合，检测前列腺癌相关的DNA甲基化和血清中microRNA靶标含量。通过对前列腺癌发生及早期发展过程中基因变化分析，研究多个基因与前列腺癌的累积叠加效应，发展具有高特异性、高灵敏度的前列腺癌早期预警技术。 3.3 新型前列腺癌纳米检测技术的性能评价 对课题中建立的多种前列腺癌检测方法进行性能评估。主要指标包括：准确度、精密度、线性范围、最低检测限（分析灵敏度）、特异性、高浓度Hook效应及样本稀释、参考值（范围）确定和试剂稳定性研究等。4前列腺癌纳米检测技术在筛查与验证中的应用研究 对于建立的疾病检测方法，必须利用实际样本进行检验后才能判断其临床价值。拟建立并完善前列腺癌生物样本库与在线数据库，并用于评价本项目建立的PSA电化学传感器在前列腺癌诊断和治疗中的临床价值。结合本项目发展的基于多元协同界面的多种前列腺癌靶标检测方法，筛选出针对前列腺癌的“最佳肿瘤标志群”，建立多指标联用预测模型并进行评价。4.1 前列腺癌临床病例选择及生物样本库的建立 建立包括前列腺癌组，前列腺癌术后组和前列腺良性疾病组（前列腺增生等）在内的在线数据库，支持远程提取与信息共享。各组病例要求不小于300例，具备完整临床资料和随访情况。提取相关人员的外周血样本、前列腺液与前列腺组织，建立相关的生物样本库。4.2 电化学纳米生物传感器的临床前研究 对发展的基于PSA靶标的电化学生物传感器进行临床价值评估，评价其在前列腺癌早期发现和筛查、鉴别诊断与分期、预后判断、疗效监测和复发等应用中的实际价值。重点评估PSA电化学生物传感器的检测时间、方便程度，并进行经济学评价。 4.3 多指标联用预测模型的构建及评估 利用建立的前列腺癌生物样本库，使用基于多元协同界面的纳米生物检测系统对相关靶标分子进行检测。将得到的大量数据进行建模分析，研究这些不同靶标分子对于判断前列腺癌发生和发展的响应性以及多个靶标分子之间的相互关联情况。应用粗糙集归类、遗传算法、递归特征消除等算法，选择影响前列腺癌诊断的主要特征。同时结合支持向量机、随机森林、贝叶斯网络等机器学习算法以及一致性模型思想，建立多指标联用的前列腺癌诊断模型，根据建立的模型对前列腺癌进行诊断以及对可能出现前列腺癌的几率做出评估。重点考察多指标联用的前列腺癌诊断模型的特异性指标，考察是否有效降低了假阳性。 二、预期目标总体目标： 基于新兴的纳米技术和生物技术，以前列腺癌为研究对象，发展针对前列腺癌各种靶标的高灵敏生物传感新技术和新方法。总体而言，本项目拟在深入研究纳米尺度界面上生物分子吸附、组装和折叠的基本物理化学原理的基础上，通过多元、协同纳米界面的设计与构筑提高生物检测方法的抗干扰能力、灵敏度以及特异性，从而大幅度提高我国纳米生物检测技术的创新能力和应用水平。具体而言，我们期望研制“器件化”的便携、灵敏、快速、廉价的电化学纳米生物传感器件，用以满足前列腺癌大规模低成本筛查及前列腺癌术后的预后评价与监测的要求；发展针对多种不同靶标的纳米生物检测系统，并应用生物信息学的方法研究这些不同靶标分子对于前列腺癌的响应性,建立多指标联用的前列腺癌诊断模型，从而显著提高临床诊断准确性。同时，建立与完善大规模的前列腺癌生物样本与数据库，并对发展的前列腺癌早期检测技术进行临床验证。期望通过本项目的研究，能够在前列腺癌的早期检测及预后监控方面发挥作用，为在我国建立前列腺癌的普查机制、提升前列腺癌早期诊治能力贡献力量。 五年预期目标：以多元、协同纳米界面的设计与构筑为核心，发展多种针对不同靶标的纳米检测新技术和新方法，突破前列腺癌早期诊治特异性及灵敏度方面的世界性难题，为前列腺癌的早期检测及预后监控提供先进手段。 1）通过深入研究纳米尺度界面上生物分子吸附、组装和折叠过程，揭示其中的基本物理化学原理，设计并构筑在局域空间内可协同发挥多功能的多元、协同纳米界面，以显著提高生物传感器的抗干扰能力、灵敏度以及特异性。 2）设计并制备具有多元、协同传感界面的电化学电极，发展具有自主知识产权的、针对PSA和fPSA靶标的便携式电化学纳米传感器，实现对PSA/fPSA的简便、快速、廉价检测。可同时实现 16或96通道筛查，检测限优于纳克(ng)水平，检测时间在1小时内完成。 3）发展针对蛋白靶标、基因水平的甲基化靶标、microRNA靶标和小分子代谢物靶标等多个水平、多种指标的纳米生物检测方法。对蛋白、DNA和RNA靶标的检测限优于皮克(pg)水平；小分子优于微克(mg)水平。4）建立前列腺癌样本库，对研制的便携式电化学纳米传感器进行临床前评估，病例数不低于300例。结合发展的面向多种靶标的纳米检测方法与临床病例，使用生物信息学方法研究这些靶标分子对于前列腺癌的响应性，建立前列腺癌多指标联用预测模型，并进行评估。 5）在纳米与医学的交叉领域做出一批国际先进水平的重大成果，发表SCI论文100篇以上，其中50篇以上发表在各相关领域的权威刊物上；申请中国发明专利10-15项，美国专利1-2项。 三、研究方案1） 学术思路 以多元、协同纳米界面的构筑为核心，发展针对不同靶标的纳米生物检测方法，并研制两套具有不同特征与功能的纳米器件（廉价的电化学生物传感器；高特异性的多指标联合检测系统），致力于提升前列腺癌的早期检测水平。具体而言： 一个目标：提升前列腺癌的早期检测水平； 两个器件：快速、便携、廉价的电化学生物传感器；高灵敏、高特异性的多指标联合检测系统； 多种方法：针对PSA筛查电化学检测；针对多种蛋白靶标的时间分辨荧光检测，针对DNA甲基化与microRNA 的共轭聚合物荧光检测方法和针对小分子代谢物靶标的核酸适配体荧光检测； 基础核心：多元、协同纳米界面的构筑 2）技术途径 1. 界面纳米结构的构筑与生物分子作用机制的研究 对蛋白质（抗体）、DNA和核酸适配体等生物识别分子在纳米界面的组装过程的研究是提高生物传感检测性能的关键问题。本课题将综合运用各种先进表面分析技术，在多个层次上系统研究蛋白质（抗体）、DNA及核酸适配体等生物分子在界面组装过程中的物理化学特性，如构象、取向、动力学和折叠自由能等。通过与其溶液状态及在宏观界面上的行为的比较，形成生物分子在纳米界面组装和识别过程的清晰图景，并建立其与生物传感性能之间的联系。 1.1纳米探针界面与传感界面纳米结构的设计与合成 拟通过合成条件的控制以得到一系列尺寸可控、水溶性及单分散性好的纳米材料，并优化材料的各种物理化学性能。其中碳纳米管将直接使用商业产品，其它材料的合成方法如下：1）采用水相超声辅助的合成途径，得到尺寸控制更为准确单一、发射峰尖锐且波长可调、并具备更强发光效率的II-IV族量子点纳米材料；2）通过氯金酸水相还原合成和晶种诱导生长的方法制备各种直径的金纳米粒子和不同长径比的金纳米棒，并具备从可见光到近红外光（520-900 nm）的等离子体共振吸收性能；3）采用二甲基硅烷水解法制备Eu掺杂二氧化硅纳米颗粒，或通过溶剂热合成方法制备含Eu的稀土氧化物/氟化物纳米晶（包括Y2O3:Eu、NaYF4:Eu），具备尺寸小、均一性好、且具有高荧光量子产率和长荧光寿命等特性；4）设计合成不同亲/疏水性质的共轭聚合物嵌段，通过尺寸形貌调控获得高发光强度、长发光寿命的共轭聚合物纳米材料（纳米粒子和纳米棒）。 在金、碳或硅基底表面通过化学刻蚀、纳米材料嫁接或电化学原位可控生长等方面构筑精细纳米结构，主要包括纳米粒子辅助的硝酸或氰化物刻蚀技术来制备有序的纳米线阵列或图案；通过将化学合成的纳米金材料通过沉积或化学键合等方法固定在基底上形成复合纳米结构；通过电位精确控制金属在基底上的还原和可控生长，获得尺寸均一、晶面可控纳米粒子或具有精细结构的纳米花等。并通过工艺控制建立一套简便而又重复好的界面纳米结构构筑流程。 对材料的表面有针对性地通过亲水基团的引入或两亲高分子（如PEG修饰的磷脂）包覆进行修饰和改性，以增强其水溶性和在生理溶液如血清、尿液等中的稳定性（无团聚沉淀）。同时，为了减少检测的背景和噪声，尽可能降低纳米材料表面对生物分子和其他界面的非特异性吸附。 1.2 纳米界面上生物分子理化机制研究 系统研究生物分子在溶液态的和连接在纳米界面后的热力学以及构象变化，并且对两者物理化学性质进行比较。拟利用同步辐射（小角散射SAXS、近边吸收谱NEXAFS等）、多种稳态和瞬态光谱、电化学、原子力显微镜、表面表征技术（如椭圆偏振、石英晶体微天平、表面等离子体共振分析仪）等一系列先进分析技术系统来研究生物分子在纳米界面的物理化学过程。如应用石英晶体微天平（QCM）和表面等离子共振（SPR）来测量生物分子在界面的结构变化；通过光谱和电化学方法检测生物分子的表面密度；通过时间分辨荧光及电化学方法来研究生物分子在界面折叠的动力学过程；通过NEXAFS研究界面生物分子的取向；通过SAXS研究纳米界面的生物分子构象等。 通过上述研究手段，系统研究特定修饰的界面对生物分子折叠自由能的影响，以及这些作用怎样通过改变界面环境（组装密度、表面电荷等）来调节；通过测量生物分子在界面的构象变化，增强对探针和界面组装如何影响其动力学过程的理解；探索界面诱导效应，揭示相关的热力学原理以深入了解生物分子在界面的构象变化，并基于构象信息在热力学和动力学上来提高生物分子识别能力；研究在光、电、磁等外场影响下，纳米界面上生物分子的构象变化以及如何调控电子电荷输运及光电转换等。1.3 多元、协同纳米界面的构筑 通过系统研究界面纳米结构与生物分子之间的相互作用，了解生物分子在不同界面上的构型及排列情况，以及在界面上的吸附、凝聚与扩散等特性，利用对界面纳米结构修饰的化学基团、间隔基的长度、间隔基及端基（如寡聚乙二醇等）来精确控制多种生物分子在其表面不同区域的组装，设计并构筑一个在局域空间内可协同发挥多功能的多元、协同纳米界面。通过研究界面上的电荷转移、能量转移以及电子耦合机制，并通过自组装参数的改变，以揭示界面组装机制，深入了解多元协同界面上的功能集成效应、功能融合效应，功能调控效应等。 为了使纳米探针具有特异性识别待检测前列腺癌靶标分子的能力，需要将不同种类的纳米材料通过表面特定功能团与能识别前列腺癌靶标的生物分子进行可控的分子键偶联。根据待检测物的不同，偶联的生物分子将包括蛋白和核酸两大类。其中PSA和其他前列腺癌相关蛋白的检测主要通过抗体对PSA和这些蛋白分子的特异性识别来实现；microRNA的检测主要通过具有互补序列的核酸链的杂交配对来实现；小分子肌氨酸则通过核酸适配体对其的特异性结合得以实现。偶联的化学方法主要利用纳米材料表面上自由功能基团如羧基和氨基，在偶联试剂作用下与生物分子的氨基、羧基或巯基偶联。利用这些偶联技术，构建用于针对前列腺癌靶标分子检测的具有超灵敏度和特异识别能力的纳米生物探针。偶联反应过程中需要保持生物分子的特异性识别功能；构建的探针产物需要进行严格纯化和分析；得到的纳米探针的稳定性及其在复杂生理环境下的各种物理化学性能也需要进行仔细的研究。 2. 基于多元协同界面的电化学纳米生物传感器研究 电化学分析方法的测试信号来源于界面上的电子传输或界面电学特性的瞬变。灵敏度和响应速度取决于界面的传质速率和电子交换速率，在特定的基体也就取决于修饰界面的特性；识别能力、选择性则取决于电极的功能化程度和可控程度；传感器的寿命、稳定性、测定范围、检测限以及其它宏观响应的特性既与待测物质的物性有关，又取决于组装与修饰界面物质的性质及其微结构。电化学生物传感器将生物探针固定在电极上,并将界面发生的生物分子识别反应通过电信号导出，从而实现对生物分子的识别。通过构筑纳米界面并结合纳米信号探针的放大技术，能够发展手持式的便携、灵敏、廉价的电化学纳米生物传感装臵，实现对PSA的快速灵敏检测以满足前列腺癌大规模低成本筛查的要求。 2.1设计电化学电极的多元协同传感界面，制备PSA抗原响应性电极 采用丝网印刷技术制备表面均一的电极和电极阵列。通过对表面纳米改性，在电化学辅助下形成一层纳米金均匀修饰的生物相容性界面。通过巯基-金键作用，将生物捕获探针（对PSA特异性识别的抗体或抗体片段）共价组装在纳米金相容性界面上，制备对PSA抗原有特异性响应的生物敏感膜修饰电极。通过纳米金修饰可以有效提高表面积，以增加抗体的表面覆盖度，并通过纳米界面的形成提高扩散速度，增加PSA到表面的扩散能力，并提高抗原-抗体结合的能力。 应用纳米组装技术构建纳米生物信号放大探针。选择生物识别探针分子（对PSA特异性识别的抗体或抗体片段，与捕获探针配对），通过巯基-金键或氨基-羧基的成肽反应等共价连接方式，利用其本身携带或衍生的基团实现其与纳米粒子表面的偶联；设计信号负载体（DNA寡核苷酸或酶聚合体）修饰方案，同样，通过共价连接方式，使负载体与纳米粒子表面实现偶联。优化反应物比例、溶剂、温度、离子强度、pH值、时间、催化剂等各项偶联条件，控制探针和信号载体的组装数量及三维形态，使该纳米复合结构中的生物分子保持后续生物反应活性（蛋白质探针的配体识别性能和信号放大性能）；同时减少两种生物探针分子与纳米粒子之间的非特异性结合，通过洗涤、更换溶剂、提高离子强度等方法，优化该纳米生物复合结构的后处理条件，提高其稳定性和耐受性。 2.2 研制基于电化学传感技术的PSA检测平台 将上述具有特异性的生物敏感膜修饰电极和纳米信号放大探针通过区域模块装配的模式设计研制用于单样品检测的单通道探头和多样品并行检测的多通道传感探头。在该探头的前端设臵样品前处理模块（核心部件为滤膜或滤芯等），主要用于对复杂生物流体（血清或血浆）中的高丰度干扰物质（如血细胞和白蛋白等）进行过滤，排除其在生物捕获敏感区域的非特异性吸附而造成的信号干扰，并有利于提高捕获探针和信号探针的结合能力，改善信噪比。探头区域的流体动力控制通过微流控结构或微管路系统来实现与检测平台衔接。 通过生物传感探头与电化学检测及数据分析模块的集成构建快速电化学生物检测技术平台。调试传感单元、控制单元、信号采集与放大单元、数据处理单元的稳定性和协同性。通过用户友好型的软件界面使单/多通道便携式电化学生物传感器的功能得以呈现。 2.3 电化学纳米生物传感器的综合评价 对于所制作的单/多通道便携式电化学生物传感器，应用多种实验和仪器手段（包括电子学和化学分析仪器），进行其物化性能指标的综合评价。优化制作条件，使其综合性能指标误差控制在合理范围以内。然后，将该传感器初步应用于血清或血浆样品PSA的检测。分析灵敏度、特异性、准确度、精确度、相关性等生物检测技术指标，评价所构建的多通道便携式电化学生物传感平台在复杂生物体系中的表现，验证其在超微量生物传感探测中的性能。 3. 基于多元协同界面的前列腺癌标志物的纳米生物检测方法研究 为了进一步提高前列腺癌早期诊断的特异性，发展包括多种靶标的联合检测方法是一个行之有效的途径。为此，需要建立针对不同靶标的纳米检测方法。本课题拟基于时间分辨荧光和共轭高分子探针两个平台发展PSA和其它新型蛋白靶标、基因水平的甲基化靶标、microRNA靶标和小分子代谢物靶标等多种指标的联合检测技术，为利用多指标联合检测来有效降低PSA筛查中的假阳性率提供技术平台。3.1建立基于时间分辨荧光检测的蛋白质和小分子检测系统 时间分辨荧光具有灵敏度高，复杂组分辨识度好等优点，作为一种常规的检测手段在生物传感方面发挥着其优势，是定量测定蛋白质和小分子的常用方法。而利用具有光物理和光谱特性的稀土材料标记靶标，可以使样品不受自然荧光干扰，从而达到极高的信噪比。因此，我们将通过纳米技术与以上两方面技术的融合进一步提高检测平台的灵敏度：1）将抗体或制备的抗体片断捕获探针固定在微孔板上，通过界面纳米设计实现抗体探针的均一、定向组装，以提高在界面的识别捕获效率。2）利用课题一设计的稀土（Eu)纳米粒子与二抗构建纳米信号探针。每个探针中含有数千至数万个Eu稀土原子，可以激发产生比常规稀土Eu标记高3-4个数量级的时间分辨荧光，易于信号的捕捉，从而显著提高目标的检测灵敏度。 具体体现在：1）实验验证界面纳米调控对于提高界面反应中的效率和降低背景信号等方面的作用；2）将基于稀土纳米粒子的分析结果与同等情况下的基于Eu标记的结果进行比较，评价纳米探针在灵敏度、特异性方面的优势；3）将同步分析多种类和多浓度的蛋白和小分子靶标（PSA，fPSA，肌氨酸等），建立稀土纳米粒子的信号与靶分子种类及浓度之间的对应关系图谱，依此得出多元分析的灵敏度、信噪比、重复性、稳定性和信号均一性等性能指标；4）将含有多种类高丰度干扰蛋白的体液样本进行基于上述平台的多批次分析，评价对生物样本中低丰度蛋白进行分析的灵敏度和特异性状况；5）检验其性能并验证复合探针对提高低丰度蛋白分析的阳性率和抗杂蛋白干扰等方面的优越性。 3.2建立基于核酸扩增和水溶性共轭聚合物信号放大的核酸检测系统 共轭聚合物具有强的光捕获能力，具有倍增光学响应性，可用来放大荧光传感信号。基于共轭聚合物的新型生物传感器在医疗诊断、基因检测、环境检测以及国家安全防御等方面具有广泛的应用前景。在本研究中将利用水溶性共轭聚合物探针的高效荧光信号放大作用，通过将核酸扩增与荧光共振能量转移（FRET）技术结合起来检测前列腺癌相关的DNA甲基化和血清中microRNA靶标含量，优化检测条件，提高检测的准确性和灵敏度。 在检测原理上这一部分拟分为两种方法，一种为传统的由共轭聚合物向有机染料的荧光能量共振转移，通过测量放大后的稳态荧光传感信号进行生物分子的检测。另一种方法拟将共轭聚合物纳米材料探针与稀土纳米探针相结合，通过能量共振转移放大稀土纳米探针的瞬态时间分辨荧光信号进行生化检测。这两种方法中前者通过稳态荧光的FRET检测方法已经成熟，可行性好，将直接用作项目中前列腺癌相关分子的检测；而后者通过瞬态荧光的FRET检测技术有可能进一步提高现有检测方法的灵敏度，将作为新的技术手段进行研发。 利用共轭聚合物荧光探针通过FRET技术，结合单碱基延伸反应以及甲基化DNA特异性剪切酶，检测DNA甲基化以及碱基突变。具体体现在：1）针对前列腺癌病人以及正常人群血浆、血清、尿液样本提取DNA，对相关基因的甲基化程度进行系统分析；2）研究前列腺癌病人P504 s、P63、CK34、El2等易感基因的突变，探索疾病与特定基因以及多个联合基因的关联性；3）通过对前列腺癌发生及早期发展过程中基因变化分析，研究多个基因与前列腺癌的累积叠加效应，发展具有高特异性、高灵敏度的前列腺癌早期预警技术。 microRNA在血液中通常以极微量形式存在，因而需要扩增技术来提高其浓度。我们之前已发展了滚环扩增（RCA）的技术，通过设计核酸纳米结构作为引物，可以有效将极微量的microRNA靶标从样品中扩增出来。之后我们通过共轭聚合物探针的高效荧光共振能量转移效应，可以实现microRNA的高灵敏荧光检测。 3.3新型前列腺癌纳米检测技术的性能评价 根据国家食品药品监督管理局体外诊断试剂相关规定，对发展的前列腺癌生物标志纳米检测技术进行性能评估，主要包括：准确度、精密度、线性范围、最低检测限（分析灵敏度）、特异性、高浓度Hook效应及样本稀释、参考值（范围）确定和试剂稳定性研究等。 4. 前列腺癌纳米检测技术在筛查与验证中的应用研究 整体技术思路如下图所示： 4.1前列腺癌临床病例选择及生物样本库的建立 前列腺癌组和前列腺良性疾病组（前列腺增生等）为上海交通大学医学院附属仁济医院泌尿外科就诊患者，前列腺疾病确诊均依靠经直肠B超引导下前列腺穿刺活检证实。正常对照为正常健康男性，年龄与实验组均衡，无任何已知的良性或恶性疾病、外表正常、无任何可见疾病症状的人。各组病例至少300例，每一组受试者的最小入选人数均满足统计学分析的基本要求，所有入选病例均签知情同意书，并具备完整临床资料和随访情况。 外周血样本经抗凝和离心处理分两部分分装，一部分为血清，另一部分为血细胞，分别置-20度保存；前列腺液经前列腺按摩采集，无菌试管内置-80度保存；前列腺组织经穿刺或手术切除后置无菌试管内，后置-80度保存备用。 4.2电化学纳米生物传感器的临床前研究 在样本库中的前列腺相关的良恶性疾病组和正常对照人群组选取至少各300例，使用发展的电化学纳米生物传感器对PSA进行检测，测试其临床灵敏度和特异性，并利用ROC曲线确定合适的参考值（范围）。另外，至少对100例特定的前列腺癌患者进行手术前后的随访监测研究，以考察该纳米生物传感器在前列腺癌预后判断、疗效监测和复发等应用中的价值。对临床试验结果的统计选择合适的统计方法，如相关分析、线性回归、受试者工作特征（ROC）曲线分析、灵敏度、特异性、准确度、阴/阳性符合率、cut-off值等；对于对比实验的等效性研究，主要是对考核试剂和参比试剂两组检测结果的相关及线性回归分析，重点观察相关系数（r值）或判定系数（R2）、回归拟合方程（斜率和y轴截距）等指标。 同时对该电化学纳米生物传感器进行经济学评价，主要包括费用-最小化分析、费用-有效性分析、费用-有益性分析和费用-有用性分析。4.3 多指标联用预测模型的构建及评估 利用建立的前列腺癌生物样本库，使用基于多元协同界面的多种纳米传感方法对相关靶标分子进行检测。将得到的大量数据作为统计分析的X矩阵，应用遗传算法、递归特征消除等算法从实验得到的大量指标中选择影响前列腺癌诊断的主要特征，研究这些不同靶标分子对于判断前列腺癌发生和发展的响应性以及多个靶标分子之间的相互关联情况。结合支持向量机、随机森林、贝叶斯网络等机器学习算法以及和一致性模型思想相结合，建立多指标联用的前列腺癌诊断模型，根据建立的模型对前列腺癌进行诊断以及对可能出现前列腺癌的几率做出评估。此外，用多种模型验证方法对模型的稳定性、可靠性以及应用域等进行合理的评价。重点考察多指标联用的前列腺癌诊断模型的特异性指标，考察是否有效降低了假阳性。4.4分子靶标检测与临床特征的关系研究 基干血清或体液（前列腺液）样本的基因，蛋白和小分子代谢物靶标检测具有取样方便，检测方法易定量，流程快速和便于质量控制等优点，而基干组织样本的基因或蛋白检测具有特异性强，敏感性高，定位准确，形态和功能相结合的优点，比较分子靶标在两类样本中检测效能，确定基于血清或体液分子靶标检测的有效性；通过分析分子靶标与前列腺癌患者临床特征（年龄，瘤体大小，分期，分级，ER和PR表达，有无淋巴及远处转移，预后，生存期等）相关性，确定其临床实用性，深度挖掘分子靶标在前列腺癌鉴别诊断与分期，预后判断，疗效监测和复发判断中价值。3）创新点与特色： （1）在研究对象上，直面前列腺癌早期检测这一具有很强针对性和现实性的问题。前列腺癌是在我国随着老龄社会的到来正面临“爆发”，而多年来的临床结果证明前列腺癌研究相对透彻，可干预性好，即在早期发现后的治疗有效，死亡率低。本项目特别针对我国的现实情况，基于电化学检测方法发展便携式的快速、廉价的纳米生物传感器用于前列腺癌的早期普查，希望对我们的前列腺癌能实现有效的控制和降低致死率。本项目的另一个重要方面是希望通过多指标联合检测，显著降低基于PSA筛查的假阳性率，减少患者需穿刺活检的痛苦。 （2）在研究思路上，以纳米界面生物分子的作用机制为突破口。通过深入研究纳米界面上的生物分子的物理化学过程，揭示其在扩散、对流和反应过程中的特殊纳米效应。特别是通过向生物体学习，设计多元、协同的纳米界面来同时解决生物检测中灵敏度和选择性问题；通过对生物分子在纳米界面上的识别过程中的构象变化信息的理解来设计全新的生物传感策略以增强特异性。在此系统研究基础上，研制出具有通用的，可在不同种类的高干扰背景下检测出超低浓度的靶标分子的纳米生物检测方法。（3）在应用出口上，重点突出纳米生物检测新原理和新方法的器件化。通过本项目的开展我们将研制出一套具有自主知识产权的电化学纳米生物传感器件，用于前列腺癌的早期筛查；以及一套多指标联合检测系统，用于前列腺癌的早期高特异性验证。这两套器件可以联合配套使用，即用电化学纳米生物传感器件进行大规模筛查，发现的前列腺癌疑似病例再用多指标联合检测系统进行复查。复检阳性结果的病人才需要进行进一步的穿刺活检，从而大幅降低临床穿刺的假阳性。这两套器件的研发将有助于前列腺癌的防治工作，而且有可能成为一个通用型的检测平台，应用于其它肿瘤或传染性疾病的检测。 4) 课题设置课题1 ： 界面纳米结构的构筑与生物分子作用机制的基础研究 经费比例： 21% 承担单位： 苏州大学、中国科学院高能物理研究所课题负责人： 刘庄 课题2 ： 基于多元、协同界面的电化学纳米生物传感器研究 经费比例： 21% 承担单位：南京大学、上海交通大学 课题负责人： 徐静娟 课题3 ： 基于多元、协同界面的前列腺癌标志物的纳米生物检测方法研究 经费比例： 30% 承担单位： 中国科学院上海应用物理研究所、中国科学院化学研究所 课题负责人： 樊春海 课题4 ： 前列腺癌纳米检测技术的临床应用评价研究 经费比例： 28% 承担单位： 上海交通大学、南京大学 课题负责人： 黄钢 四、年度计划研究内容预期目标第一年合成一系列高质量的功能纳米材料，并实现其可控生长和粒径可调；在金、碳或硅基底表面构筑精细纳米结构，并建立一套简便、重复性好的界面纳米结构构筑的工艺流程；运用自组装、原位沉积等传感界面固定化方法，制备对PSA抗原有特异性响应的生物敏感膜修饰电极。通过多元协同纳米界面的设计与优化，在电极和电极阵列界面上构建纳米结构，保持配体的稳定性以及高效的识别能力；通过纳米技术与时间分辨荧光检测技术的融合进一步提高检测平台的灵敏度，重点解决抗体在界面上的固定与纳米探针的制备问题；建立前列腺癌临床病例选择及生物样本库，对临床试验结果的统计选择合适的统计方法同时对该电化学纳米生物传感器进行经济学评价。 得到一系列高质量的功能纳米材料并和各种精细纳米结构界面；建立通用的PSA特异性传感界面组装方法；在纳米界面上实现抗体探针的均一、定向组装，提高在界面的识别捕获效率；构建纳米信号探针，每个探针中含有数千至数万个Eu稀土原子，可以激发产生比常规稀土Eu标记高3-4个数量级的时间分辨荧光；收集前列腺癌组和前列腺良性疾病组不少于100例，建立和完善前列腺癌生物样本库管理系统，建立前列腺癌生物样本库质量控制体系。在此过程中发表研究论文15-20篇，申请专利3-5项。第二年对纳米界面进行表面修饰与改性，实现生物识别分子在纳米探针界面上的偶联，制备可用于前列腺癌肿瘤标志物检测的纳米生物探针；发展基于能量转移的新原理和信号传导与放大的新方法，实现生物识别信号的放大。设计与制备各种类型的阵列式传感基片，以及相配套的微流体通道及检测装置，提供集成式的阵列微流体传感分析系统；将同步分析多种类和多浓度的蛋白和小分子靶标，建立稀土纳米粒子的信号与靶分子种类及浓度之间的对应关系图谱；评价对生物样本中低丰度蛋白进行分析的灵敏度和特异性状况；进行电化学纳米生物传感器的临床前研究，对前列腺癌患者进行手术前后的随访监测研究。制备获得一系列可供前列腺癌检测的纳米生物探针和纳米生物界面，建立针对前列腺癌标志物的特异性信号传导和放大方法，建立阵列式微流体传感分析系统；建立针对前列腺癌标志物的特异性时间分辨荧光信号传导和放大方法，初步建立相关分析系统；继续收集前列腺癌组和前列腺良性疾病组不少于100例， 建立多指标联用的前列腺癌诊断模型，根据建立的模型对前列腺癌进行诊断以及对可能出现前列腺癌的几率做出评估。在此过程中发表研究论文20-25篇，申请专利3-5项。第三年对生物分子在纳米界面上的时空行为和动态结构进行高分辨、高灵敏表征，并进一步通过对特定分子功能团进行选择性剪裁和修饰，实现对纳米界面上生物分子的结构和功能的调控。通过利用光、电、磁外场的影响，研究该纳米生物体系中的结构变化、电子电荷输运、光电转换的问题以及相关的运作原理；研制能够自动过滤干扰物质的样品检测传感探头与传感器的信号检测与数据分析模块，构建针对PSA标志物的集成化和程序化的微芯片电化学传感检测平台；建立基于核酸扩增和水溶性共轭聚合物信号放大的核酸检测系统；利用共轭聚合物荧光探针通过FRET技术检测DNA甲基化以及碱基突变；运用多指标联用预测模型的构建及评估利用水溶性共轭聚合物探针的高效荧光信号放大作用，通过将核酸扩增与荧光共振能量转移（FRET）技术结合起来检测前列腺癌相关的DNA甲基化靶标含量，优化检测条件，提高检测的准确性和灵敏度；继续收集前列腺癌组和前列腺良性疾病组不少于100例，建立多指标联用的前列腺癌诊断模型，根据建立的模型对前列腺癌进行诊断以及对可能出现前列腺癌的几率做出评估。在此过程中发表论文20-25篇，申请专利3-5项。第四年在深入理解界面生物分子作用机制的基础上，进一步改进纳米材料的合成，优化纳米生物界面，提高针对前列腺癌肿瘤标志物纳米探针的性能，包括提高灵敏度、准确度、以及重现性；综合评价所构建的便携式电化学生物传感平台在多种复杂生物体系中的表现，验证其在实际生物体系中探测的性能；发展针对microRNA的检测技术，通过共轭聚合物探针的高效荧光共振能量转移效应，实现microRNA的高灵敏荧光检测；进行分子靶标检测与临床特征的关系研究，利用建立的前列腺癌生物样本库，使用基于多元协同界面的多种纳米传感方法对相关靶标分子进行检测。实现多通道便携式电化学生物传感平台在复杂生物体系中的应用；通过将核酸扩增与荧光共振能量转移（FRET）技术结合起来检测前列腺癌相关的DNA甲基化和血清中microRNA靶标含量，优化检测条件，提高检测的准确性和灵敏度；通过分析分子靶标与前列腺癌患者临床特征相关性，确定其临床实用性。在此过程中发表论文25-30篇，申请专利3-5项。第五年完善纳米界面和纳米探针的各项指标，优化各项工艺，实现低成本、重现性强、性能稳定可靠的界面以及探针的制备。根据后续课题的需求，对较有临床应用推广前景的纳米探针和界面体系全面完成实验室研究工作；争取在多元、协同纳米界面上生物分子作用机制的基础研究及电化学生物传感器的研制等方面取得突破；进行新型前列腺癌纳米检测技术的性能评价，对发展的前列腺癌生物标志纳米检测技术进行性能评估；进行前列腺癌相关诊断试剂盒临床前期研究。总结研究成果，完善纳米生物探针和纳米生物界面的各项制备工艺，归纳在多元、协同纳米界面上生物分子作用机制的一般规律，在电化学生物传感器的研制上实现突破；实现多靶标检测系统的研制；并开展体外诊断试剂盒的临床前期研究。在此过程中发表论文25-30篇，申请专利3-5项。