乳酸杆菌的分离、鉴定及其益生功能的体外评价

乳酸杆菌的分离、鉴定及其益生功能的体外评价目的从母乳标本和健康新生儿粪便标本中筛选出具有耐酸、耐胆盐能力的乳 酸杆菌，并通过体外实验对其进行降胆固醇，抑制病原菌，抗毒素和免疫调节能力 的评价，以期获得具有良好益生功能的乳酸杆菌作为益生菌候选株进行进一步地 研究和开发。方法一、乳酸杆菌的分离和鉴定:将母乳标本和新生儿粪便标本系 列稀释后均匀接种于MRS培养基中，培养48h后通过观察菌落形态挑选可能的乳 酸杆菌;再通过16s rDNA的初步鉴定以及耐酸、耐胆盐实验的筛选;最后对所得 菌株进行API 50 CHL生化鉴定。二、(1)体外降胆固醇能力评价:采用Wako试剂盒检测实验菌株培养上清中 的胆固醇含量;观察细菌活性、培养时间和接种量对降胆固醇能力的影响;利用无 水乙醇洗脱沉淀中的胆固醇探索菌株的降胆固醇机制。(2)体外拮抗病原微生物 能力评价:采用琼脂扩散法初步比对了实验菌株发酵上清对E.coli 0157:H7、 Shigalla sonnei和Salmonella typhimurium的抑菌能力；采用蛋白酶K干预和 调节pH值的方法对发酵上清进行处理，研究影响抑菌效果的因素。(3)体外抗毒素能力评价:vibrioulnificus(Vv)和E.coli 0157:H7的无细菌 培养上清(Cell free culture supernatant,CFCS)与待测乳酸杆菌共同孵育3h 后分别与Caco-2细胞和Vero细胞作用，12h后用LDH释放法检测含毒素上清引 起的细胞毒性变化。三、植物乳杆菌DOMLa的抗炎能力评价:选择合适剂量的Vv 诱导小鼠腹腔巨噬细胞(PM)建立体外炎症模型，同时加入不同剂量的植物乳杆菌 DOMLa干预，作用3h后，采用LDH释放法检测细胞毒作用，并采用ELISA法检测炎 性细胞因子IL-6、IL-1(3和TNF- a的释放量。结果一、筛选得到10株具有耐酸、耐胆盐能力的乳酸杆菌，经鉴定它们为: 植物乳杆菌Y7-4，植物乳杆菌Y13、德氏乳杆菌Y20,嗜酸乳杆菌H104-2,发酵乳 杆菌H109、发酵乳杆菌H115-5以及植物乳杆菌H121-2、植物乳杆菌H137-1、 植物乳杆菌H155-2和植物乳杆菌H172-2。二、(1)在无胆盐的培养基中,H109 的降胆固醇能力最高，达到了 42.15%;在含有0.1%胆盐的情况下,Y20的降胆固 醇能力最强，达到90%,且从德氏乳杆菌Y20的沉淀物中可以洗脱出大量的胆固醇; 对两株菌进行热处理后，其对胆固醇的去除能力均收到明显抑制，表明Y20主要 通过共沉淀机制而H109主要通过直接吸收机制去除胆固醇。(2)Y7-4、 Y20、 H109、 H115-5 和 H121-1 的 CFCS 对 E.coli 0157:H7、 S.sonnei和S.typhimurium形成的抑菌环半径均大于4mm,其中Y20抑菌效果最 为明显;将Y20的CFCS pH值调到6.0后，抑制作用消失,而经过蛋白酶K处理后 的CFCS仍然具有明显的抑菌效果,，表明Y20的抑菌机制是产生有机酸。(3)经 Y7-4和Y20干预后的Vv上清对Caco-2的细胞毒作用由75%分别降到了 20%和 10%;而处理后的E.coli 0157:H7 CFCS对Vero细胞的细胞毒作用未见明显差异， 其它菌株也均无明显的干预效果，表明Y7-4和Y20的抗毒素作用具有菌株和毒素 特异性。三、植物乳杆菌DOMLa的抗炎能力评价:在MOI=100时，植物乳杆菌DOMLa 显著降低Vv对PM的细胞毒作用，同时也明显抑制Vv诱导PM产生IL-6、IL-1B、 TNF-a三种促炎细胞因子。结论1.出生28天以内的新生儿肠道内已经有乳酸杆 菌定植，且新生儿粪便可以作为乳酸杆菌的良好来源;2.德氏乳杆菌Y20和发酵 乳杆菌H109具有较好的体外降胆固醇能力，其中Y20主要通过共沉淀机制而 H109主要通过直接吸收机制去除胆固醇;3.德氏乳杆菌Y20具有较好的抑菌效果, 其抑菌作用主要归因于菌体代谢所产生的有机酸;4.植物乳杆菌Y7-4和德氏乳 杆菌Y20对创伤弧菌毒素表现出较好的拮抗效果，且该拮抗作用具有菌株和毒素 特异性;5.植物乳杆菌DOMLa可降低创伤弧菌对小鼠腹腔巨噬细胞的细胞毒作用 并可能通过抑制促炎细胞因子的释放而发挥抗炎作用。