流式细胞术原理与应用

流式细胞术详解一.流式细胞术概述 流式细胞术(FlowCytometry,FCM)是七十年代发展起来的高科学技术,它集计算机技术、激光技术、流体力学、细胞化学、细胞免疫学于一体,同时具有分析和分选细胞功能。它不仅可测量细胞大小、内部颗粒的性状,还可检测细胞表面和细胞浆抗原、细胞内DNA、RNA含量等,可对群体细胞在单细胞水平上进行分析,在短时间内检测分析大量细胞,并收集、储存和处理数据,进行多参数定量分析;能够分类收集(分选)某一亚群细胞,分选纯度95%。在血液学、免疫学、肿瘤学、药物学、分子生物学等学科广泛应用。国内使用的流式细胞仪主要由美国的两个厂家生产:BECKMAN-COULTER公司和Becton-Dickinson公司(简称B-D公司)。流式细胞仪主要有两型:临床型（又称小型机、台式机）和综合型（又称大型机、分析型）。BECKMAN-COULTER公司最新产品为EPICSALTRA和EPICSXL/XL-MCL,B-D公司最新产品为FACSVantage和FACSCalibur。EPICSXL/XL-MCL和FACSCalibur是临床型;EPICSALTRA和FACSVantage是综合型，除具备检测分析功能外,还具有细胞分选功能,多用于科学研究。二.流式细胞仪主要技术指标 1流式细胞仪的分析速度：一般流式细胞仪每秒检测10005000个细胞,大型机可达每秒上万个细胞。2流式细胞仪的荧光检测灵敏度：一般能测出单个细胞上600个荧光分子,两个细胞间的荧光差5%即可区分。3前向角散射（FSC）光检测灵敏度：前向角散射（FSC）反映被测细胞的大小,一般流式细胞仪能够测量到0.2m.5m。4流式细胞仪的分辨率：通常用变异系数CV值来表示，,一般流式细胞仪能够达到90%病例CD10+，而婴儿CD10+病例95%，PNH病人CD55、CD59明显减少，这种减少不仅表现在红细胞上，粒细胞、淋巴细胞也有减少。已发现CD55c可能对GPI减少或缺乏较CD59更敏感。十五.流式细胞术在血液学中应用血小板功能分析和血小板病诊断 （一） 血小板功能分析血小板膜上有丰富的糖蛋白受体，是血小板发挥其功能的物质基础，静止期和活化期血小板的膜糖蛋白受体的种类、含量、结构和功能显著不同，用不同的抗血小板单克隆抗体可测定和分析血小板功能状态。血小板质膜糖蛋白单克隆抗体CD41(GPIIb/IIIa)、CD61(GPIIb/IIIa)、CD42b(GPIb)、CD41b(GPIIb)、血小板颗粒膜糖蛋白CD62p、CD63的测定可供分析血小板功能状态，如CD62p、CD63正常血小板不表达，当血小板活化时表达明显增加，可用来测定活化血小板。（二）血小板病诊断攪1血小板相关抗体测定血小板相关抗体可因不同机制产生。抗血小板自身抗体(包括原发性、药物诱导产生、合并其它自身免疫性疾病如系统性红斑狼疮)能引起严重的血小板减少。大多数原发性(免疫性)血小板减少性紫癜病人血小板上和/或血清中有抗自身血小板的血小板相关抗体PAIgG、PAIgA、PAIgM。血小板相关抗体的抗原仍不十分清楚,可能有多种,如GPb、GPb、GPa、Pa、或HLA抗原。抗血小板自身抗体也可能发生于多次输血后或怀孕期间,这些自身抗体多为针对HLA-类抗原决定簇的抗体,一般是IgG,它们可迅速破坏和清除随机供血者的血小板。因此能迅速测定这些抗体存在与否的方法是必需的。许多不同的利用放免、荧光、酶、SPA等的测定血小板抗体的方法已建立,但这些方法都很复杂、费时;同时给出的结果只能以一定量的血小板(105)中有多少抗血小板抗体来表示。近年来发展起来的用FCM测定血小板抗体的方法具有快速、简便的优点,同时可测定血小板上和血清中的抗体;测定中FCM分析每一个血小板表面有无抗体,能给出血小板群体中有多少血小板表面有抗体(以%表示);同时能给出血小板相关抗体量与血小板数的直方图,使我们了解血小板相关抗体在血小板群体中的分布情况。FCM测定血小板抗体原理:分别用标有荧光的抗人IgG、IgA、IgM或用抗血小板GPb、b、b/a的抗体与分离洗净的病人的血小板和在病人血清中孵育过的正常O型血小板作用后用FCM测定,前者测定的是病人血小板上的抗体后者测定的是病人血清中的抗体。2血小板无力症血小板无力症时血小板膜GPIIb/IIIa明显减少，用血小板质膜糖蛋白单克隆抗体CD41、CD61和流式细胞仪测定不仅可测出GPIIb/IIIa减少，CD42a、CD42b基本正常或偏高，还可测出GPIIb/IIIa减少程度，分类血小板无力症。3.巨大血小板综合征（BSS）:血小板巨大,CD42a减少，CD42b减少，CD61增加。十六.流式细胞术在血液学中的应用微小残留白血病检测微小残留白血病(MinimalResidualLeukemiaMRL)是指白血病经治疗后获得完全缓解(CompleteRemissonCR)后体内残留少量白血病细胞的状态。微小残留白血病与明显白血病(Overtleukemia)无明确界限,仅是白血病细胞负荷数量不同,一般成人明显白血病时白血病细胞可达1012,经治疗获CR后1010,因此MRL状态白血病细胞数可能是100-10攪。MRL是白血病复发的根源,因此检测MRL有十分重要的意义:指导临床治疗预测白血病复发评价自体骨髓移植的净化效果。应用FCM检测MRL的优点在于可在短时间内分析大量标本,具有快速的特点。由于白血病细胞缺乏特异性标记,FCM检测MRL的效果尚不理想,敏感性尚不够高，一般仅有1/103-104。目前主要有两类检测方法:用FCM分析CR期骨髓细胞核酸量或染色体,可用于部分AL病人MRL分析,但敏感性仅1-5%。免疫表型分析,由于尚无白血病特异的标记,只能通过与正常细胞比较某些抗原量的差别及分布部位的不同作为检测依据;如利用TdT和CD10双标记检测MRL,但敏感性亦不高,约0.1-1%。假阴性结果可能由于:标本中的白血病细胞10-4攪或10-5;所取标本不能代表全身骨髓情况;病人白血病细胞表型转换。十七.流式细胞术在血液学中的应用白细胞吞噬功能测定 粒、单核-巨噬细胞是机体免疫反应和免疫调节细胞中的重要成员。它们不仅具有吞噬功能,吞噬外来的微生物、肿瘤细胞等,同时又分泌多种生物因子参于免疫反应,此外单核-巨噬细胞对抗原物质的摄取、修饰、递呈等作用,是淋巴细胞的免疫功能必不可少的。因此检测白细胞吞噬功能对了解机体免疫状况有重要意义。以下简要介绍FCM测定白细胞吞噬功能的概况。应用光学显微镜、荧光显微镜测定白细胞吞噬功能时须分离粒、单核细胞,并尽可能地保持细胞活性。用FCM检测时不须分离细胞,应用全血即可,因此可在自然状态下测定,结果准确可靠。目标粒子一般以酵母、细菌等能激发自然吞噬作用或予先以抗体调理化的人造粒子为好;并标以荧光,常用者为FITC(异硫氰酸荧光素)或RA(罗达明).以肝素或拘橼酸抗凝取外周血(避免用EDTA),200l全血与目标粒子200l(目标粒子浓度4107/ml)置37C温育,温育结束后立即置冰水中,以同样标本不在37C温育而置于冰水中者作为对照。目标粒子不同温育时间不一,FITC标记的金黄色葡萄球菌25分钟,FITC标记的粒子15分钟即可达到吞噬饱和;此外,粒子与白细胞的比例也很重要,一般为10:1。温育结束后以溶血剂溶去红细胞即可上机检测。 应用FCM全血法测定白细胞吞噬功能,对白细胞的丢失、损伤最小;此外用本法可测定血清中的调理素(Opsonine)水平及血清中有无吞噬作用抑制因子。如果用FITC标记的单克隆抗体CD13、CD14、CD15标记粒、单核细胞,用红荧光标记目标粒子,即可测定吞噬功能与细胞表面标记的关系,对白细胞吞噬功能作进一步的研究。十八.流式细胞术在血液学中的应用NK和LAK细胞活性测定 NK细胞存在于外周血大颗粒淋巴细胞中,它对靶细胞的细胞毒活性不依赖于抗体,无MHC限制性,它们的数量及细胞毒活性是机体免疫系统的重要指标。人NK细胞一般表达CD56、CD16、CD57部分表达CD2、CD8、CD11而不表达CD3。LAK(LymphokineActivatedKillercells)细胞主要存在于LGL的高密度群体中,LAK前体细胞表达NK细胞标志CD16而不表达T细胞标志如CD3、CD4、CD5等;它们不需要抗原刺激就能杀伤NK细胞不能杀伤的肿瘤细胞,并且无MHC限制性;从表型上看大多数LAK细胞来自NK细胞,但严格讲LAK细胞对K562细胞的杀伤活性不能称作LAK活性,测定LAK活性的靶细胞应为NK抵抗的实体瘤细胞,如HL-60细胞、HeLa细胞等。常用的测定NK和LAK细胞活性的方法较多,如攩51Cr释放法、3HTdR参入法或释放法、LDH释放法、ATP发光法等;应用放射性同位素对人体和环境不利,利用FCM测定NK和LAK细胞活性从1986年就开始摸索,方法已趋于成熟,以下介绍其中一种:肝素抗凝取外周血后分离PBMC后洗净,调整细胞浓度为106/ml,为效应细胞;靶细胞分别为K562和HL-60或HeLa细胞,在对数生长期受集细胞,调整浓度为106。用3mMDiO(3,3-DiacradecyloxacarbocyaninePerchlorate)标记靶细胞,效应细胞:靶细胞(E:T)为40:1、20:1、10:1和5:1,孵育后加入PI(10g/ml)染死细胞,洗净后即可上机检测。DiO发绿荧光,PI发红荧光,利用双参