车前草中桃叶珊瑚苷的提取及对细胞氧化损伤保护作用-最终稿 (2)

桃叶珊瑚苷提取及对细胞氧化损伤保护作用韩震 李光坤宿州学院 化学与生命科学学院摘要 本研究主要利用色谱的方法，对车前草中桃叶珊瑚苷进行了提取，并进一步测定其对氧化损伤的PC12细胞的保护作用。经过一系列的提取和分离，薄层色谱检测，最终获得白色无定形的桃叶珊瑚苷300 mg。利用过氧化氢建立直接的氧化损伤PC12细胞凋亡模型，利用MTT法检验评价桃叶珊瑚苷对细胞的保护效应。结果表明，桃叶珊瑚苷增强了细胞活力并且能够很好的抑制H2O2对PC12细胞的毒性。关键词 桃叶珊瑚苷；色谱分析；氧化损伤中图分类号： 文献标识码： 文章编号：1 引言桃叶珊瑚苷是一种广泛存在于自然界许多植物种属中的环烯醚萜类化合物，具有通便、护肝、抗微生物、止痛、抗肿瘤、抗炎、抗凋亡等多种生物学活性1-4。其分子量为346.33，味苦，易溶于水、乙醇、甲醇，不溶于氯仿、乙醚、石油醚等溶剂中。自发现天然植物种属中存在有桃叶珊瑚苷以来，相继在车前草科（Garryaceae）、玄参科（Scrophulariaceae）、球花科（Globulariaceae）、杜仲科（Eucommiaceae）等植物种属中发现了此化合物，其中以车前草和杜仲中的含量很高。桃叶珊瑚苷的主要来源为天然植物中提取，也有人利用组培的方法从杜仲的愈伤组织培提取桃叶珊瑚苷。近年来，由于桃叶珊瑚苷具有分子量小、水溶性高，易于透过血-脑屏障等优点，被广泛的应用于脑神经元细胞损伤保护的研究5，大量的研究结果表明，其保护氧化损伤的作用机制可能是通过保护细胞免受氧化损伤来实现的。因此，本研究采用色谱联合大孔吸附树脂和柱层析等方法从车前草中分离提出桃叶珊瑚苷，并进一步进行其对细胞活性保护作用研究，为其应用临床研究奠定前期理论基础。2 实验部分2.1 材料与仪器Millipore simplicity-185超纯水器（美国密理博公司）；BP211D型电子天平（sartorius）；酶标仪(美国Thermo公司)；MAXI DRY-LYO冷冻干燥系统（丹麦Heto-Holten公司）；旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）；FW100型高速万能粉碎机(天津市泰斯特仪器有限公司)。大孔树脂(天津农药股份有限公司树脂公司）；柱层析用硅胶(青岛海洋化工厂)；车前草药材(宿州市中药材批发公司)；桃叶珊瑚苷对照品(纯度 99%，美国Sigma公司)和MTT（3-(4, 5-dimethylthiazol-2-yl)-2, 5-diphenylterazolium bromide）(美国Sigma公司)；其他试剂均为分析纯。2.2 实验方法2.2.1 提取车前草5.0 kg，粉碎机粉碎，用10倍体积分数为70%的乙醇浸泡过夜，超声提取3次，每次30 min，将提取液合并，低温真空回收，置水浴锅上浓缩，离心后取上清液，注入预处理过的大孔吸附树脂，蒸馏水洗去糖等杂质，用体积分数为10%的乙醇溶液洗脱，250 mL为一个馏分收集洗脱液，薄层色谱检测，收集合并含目标点的馏分。馏分减压浓缩，将浓缩物进行硅胶柱层析，收集合并含目标点的馏分，减压浓缩，如此重复硅胶柱层析，得到层析液，收集、冷冻干燥，最后得到白色无定形粉末300 mg。2.2.2 样品检测将上述方法得到的粉末进行薄层层析色谱检测，准确称取桃叶珊瑚苷标准品0.7 mg，利用95%的乙醇溶液，将其配成浓度梯度分别为14 mg/ml、7 mg/ml和3.5 mg/ml，分别记着A、B、C。同样量取95%的乙醇溶液将样品提取物溶解，配制成浓度为10 mg/ml的样品溶液，标记为D。利用毛细吸管依此将标准品和样品溶液点在硅胶板上，每个浓度溶液点样30次，并做好记号。利用展开剂（展开剂成分按体积比配制，氯仿：甲醇：石油醚：乙酸乙酯=2：2：1：4）展开，展开结束后将硅胶板烘干，然后将显色剂萘酚-硫酸溶液喷上硅胶板，再将其烘干显色，拍照。2.2.3 桃叶珊瑚苷对PC12细胞毒性检测取对数生长期的PC12细胞，按2104个细胞接种于96孔培养板，在37、5%CO2的孵箱中培养12 h后用于实验。桃叶珊瑚苷溶于细胞培养基中做为母液，用DMEM培养基稀释成不同浓度的工作液后加入培养板中，空白对照组加入相同体积的培养基，继续培养不同时间后，按规定的时间培养后加入MTT。培养板在37在培养3 h后，MTT连同培养介质被移去，每孔中加入200 l二甲基亚砜溶解蓝紫色结晶物，用酶标仪在570 nm处测定吸收度，计算细胞活力。2.2.4 H2O2诱导PC12细胞的损伤模型构建6以2104个细胞数量接种在96孔板中。12 h后，分别加入不同浓度的H2O2。用MTT法检测细胞活力，每个处理4个平行样，所有实验做三次重复。2.2.5桃叶珊瑚苷抑制H2O2对PC12细胞损伤的细胞活力检测将不同浓度的配制的桃叶珊瑚苷样品分别加入到培养介质中，同时加入确定好浓度的H2O2，培养一定时间后，MTT法检测细胞活力。具体操作方法同上，每个处理4个平行样，所有实验做三次重复。2.2.6 数据处理根据各组检测结果计算均值，所有实验数据用平均值 Mean S.D（n=4）表示。3 结果与讨论3.1 薄层层析法检测桃叶珊瑚苷如图1所示，A、B、C分别为不同浓度的标准品桃叶珊瑚苷溶液，D为检测样品，通过此图可以看出四个样品点在同一条线上，并且标准品随着样品浓度的增加，其点的颜色加深。检测样品的颜色和7 mg/ml标准品的浓度相当，而且在其他部位没有出现斑点，由此我们可以确定提取的样品为高纯度的桃叶珊瑚苷。图1 薄层层析法检测桃叶珊瑚苷3.2 桃叶珊瑚苷的细胞毒性检测桃叶珊瑚苷与培养的PC12细胞共同孵育348 h后，在浓度为0、10、20、40和100 mg/ml时，细胞形态未见明显变化，用MTT检测细胞活力表明与对照组相比，也没有显著性差异，说明提取物的桃叶珊瑚苷对PC12细胞没有毒性作用（如图2）。图2 提取物桃叶珊瑚苷的细胞毒检测（单位：mg/ml）3.3 H2O2引起PC12细胞损伤的时间和剂量关系本实验采用本实验室前期实验的方法，并且获得了和前期结果相一致的检测结果，见图3所示。在细胞接种为2104个数量下，最终本实验确定本实验的H2O2的给药浓度为0.25 mM。因为，在此浓度下细胞的活性按照缓慢的梯度下降，在细胞给药24 h后，细胞的活力为对照组的70%左右，而不是急剧坏死，为药物治疗提供了有效的时间窗。图3 H2O2对PC12细胞的损伤剂量筛选（单位：mM）*P 0.05, *P 0.01, *P 0.001与对照组相比3.4 桃叶珊瑚苷抑制H2O2诱导PC12细胞凋亡细胞活力检测通过MTT法测定不同浓度桃叶珊瑚苷（0-100 mg/ml）作用3-24 h后，对H2O2诱导细胞损伤模型的研究。结果显示，提取物桃叶珊瑚苷对H2O2诱导的PC12细胞凋亡具有一定的抑制作用。在同一时间段，随样品桃叶珊瑚苷作用浓度的增加，对细胞损伤的抑制作用呈现出明显的剂量依赖性关系。在浓度为40和100 mg/ml两个浓度下，桃叶珊瑚苷分别作用12和24 h，和H2O2诱导组相比具有显著性差异，如图4所示。图4 提取物桃叶珊瑚苷对H2O2诱导PC12细胞凋亡的抑制作用（单位：h）*P 0.05, *P 0.01, *P 0.001与对照组相比；#P 0.05, #P 0.01, 与H2O2诱导组相比4 讨论桃叶珊瑚苷是存在于车前草中的天然活性成份之一，本提取方法可用于桃叶珊瑚苷的大量制备，此方法也为制备其它环烯醚萜苷类化合物提供了技术参考。薄层色谱检测结果表明，斑点单一，并且去标准品在同一水平线上。斑点颜色深度和7 mg/ml的标准品颜色相当，甚至比其浓度更高，说明获得产品具有很高的纯度。H2O2诱导的细胞凋亡是一种非常广泛应用的检测药物治疗氧化损伤效果的模型7。在本实验室前期研究的基础上初步确定了H2O2诱导PC12细胞损伤的作用浓度为0.25 mM。另外，本研究进一步利用MTT检测方法，检测了桃叶珊瑚苷对PC12细胞损伤的保护效果，结果表明桃叶珊瑚苷能够有效抑制H2O2引起的PC12细胞损伤。本实验也法检测了提取物桃叶珊瑚苷本身的药物毒性，结果发现在100 mg/ml浓度以下桃叶珊瑚苷对PC12细胞不具有毒性作用。综上所述，从车前草中获得大量桃叶珊瑚苷是有效可行的，并且提取物具有良好的细胞活性，为其进一步实验研究甚至进入临床应用提供了前期基础。参考文献1 Ismailoglu U B, Saracoglu I, Harput U S, et al. Effects of phenylpropanoid and iridoid glycosides on free radical-induced impairment of endothelium-dependent relaxation in rat aortic rings J. J Ethnopharmacol, 2002, 79: 193-197.2 Wang Z, An L J, Duan Y L, et al. Catalpol protects rat pheochromocytoma cells against oxygen and glucose deprivation-induced injury J. Neurol Res, 2008, 30 (1): 106-112.3 Li D Q, Bao Y M, Li Y, et al. Catalpol modulates the expressions of Bcl-2 and Bax and attenuates apoptosis in gerbils after ischemic injury J. Brain Res, 2006, 1115 (1): 179-185.4 Jiang B, Du J, Liu J H, et al. Catalpol attenuates the neurotoxicity induced by beta-amyloid (1-42) in cortical neuron-glia cultures J. Brain Res, 2008, 1188: 139-147.5 Xue H Y, Lu Y N, Fang X M, et al. Neuroprotective properties of aucubin in diabetic rats and diabetic encephalopathy rats J. Molecular Biology Reports, 2012, 39: 93119318.6 薛宏宇，李晓宇，李卫东等. 凋亡通路蛋白表达对过氧化氢诱导PC12细胞凋亡的影响J. 宿州学院学报，2011，26 (2): 40-42, 43.7 Jiang B, Liu J H, Bao Y M, et al. Catalpol Inhibits Apoptosis in Hydrogen Peroxide-Induced PC12 Cells by Preventing Cytochrome c Release and Inactivating of Caspase Cascade J. Toxicon, 2004, 43: 53-59.The Extraction of Aucubin and the Protective Effects of Aucubin in the Oxidative Cell DamageHAN Zhen LI Guang-KunDepartment of Chemistry and Life Science, Suzhou UniversityAbstract Through bioassay-guided fractionation way, the aucubin was isolated from plantain, and the protective effect of aucubin on oxidative cell damage was studied by using a rat pheochromocytoma (PC12) cell line. Through a series of extraction and separation, the aucubin obtained from plantain was determintecl by thin layer chromatography (TLC). It is an amorphous white powder and the weight of it is 300 mg. We established the indirect oxidative stress model by using H2O2-induced PC12 cells and further investigated the neuroprotective effects of aucubin by 3-(4, 5-dimethylthiazol-2-yl)-2, 5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) assay. All the result indicated that aucubin increased PC12 cellular viability and markedly attenuated H2O2-induced PC12 cell death.Key Words Aucubin; Stratographic Analysis; Oxidative Damage6