克隆点突变系列常见问题及解决方法

克隆点突变系列常见问题及解决方法一、克隆1）、平板上长不出克隆或克隆数目很少a）、感受态效率低：使用新制备或妥善冻存的感受态细胞，确保转化效率107 cfu/瞄。每次可设置一组转化质粒的对照实验，以检测感受态细胞的转化效率。b）、线性化克隆载体和插入片段扩增产物的使用量不足/过量，或者比例不佳： 请务必预先检测线性化克隆载体和插入片段PCR产物的浓度。常用的吸光度测量 法极易受DNA纯度、DNA稀释液pH等因素影响，测定值和DNA实际浓度往往偏 差非常大。因此，我们强烈推荐您通过琼脂糖电泳来测定样品中的DNA浓度。c）、载体和插入片段不纯，抑制反应：未纯化3NA加入重组反应体系内的总体积 不应超过4四1 （反应体系体积1/5）。尝试对线性化载体、PCR产物进行胶回收纯化。d）、感受态细胞中加入了过多的反应产物：反应产物的转化体积不应超过感受态 细胞体积的1/10，否则会降低转化效率。e）、当载体和片段的均大于10K时，克隆效率下降，属正常情况。f）、少数情况：插入基因本身含细胞毒性，即便有正确克隆也因为克隆细胞无法 生长导致试验失败。2）、多数克隆不含插入片段（假阳性）a）、克隆载体线性化不完全：即使是痕量未完全酶切的载体也会产生很高的转化 背景。提高限制性内切酶使用量、延长酶切反应时间、胶回收纯化酶切产物，都 可以有效减少甚至消除环状质粒残留。b）、反应体系中混入了相同抗性的质粒：PCR扩增模板（扩增克隆载体或者扩增插 入片段）为环状质粒。当扩增产物直接用于重组反应时，残留环状质粒模板会产 生较高的转化背景。尽量使用预线性化质粒作为扩增模板、扩增产物进行DpnI 消化、扩增产物进行胶回收纯化，都可以有效减少甚至消除环状模板质粒残留。3）、克隆含有不正确的插入片段a）、PCR产物混有非特异扩增产物：优化PCR体系，提高特异性；胶回收PCR产 物；鉴定更多的克隆。b）、载体线性化不完全：如果线性化载体不是由空载体酶切或扩增制备，而是由 已插入其他不同片段的载体酶切或扩增制备而成，不完全酶切或残留环状模板质 粒将导致很高的转化背景，使部分克隆中含有不正确的插入片段。提高酶切效率、 使用预线性化质粒作为扩增模板、扩增产物进行DpnI消化、扩增产物进行胶回 收纯化，都可以有效避免此类情况发生。4）、载体和片段浓度较低，达不到说明书要求a）、将质粒进行中提或大提，酶切更多质粒。b）、将载体和片段同时减半，这样会使克隆总数减少，但是比例合适的话也会有 正确的克隆。c）、设计引物，对载体进行PCR扩增，事实证明，这个方法即有效又简单。5）、弓|物Tm值过高a）、计算引物退火温度时，只需计算基因特异性引物扩增序列的Tm值，载体末 端同源序列不应参与计算。二、点突变1）、质粒模板无法正常扩增a）、引物设计有误：核对引物设计方案。b）、扩增体系配制错误：重复实验。c）、扩增反应条件不优化：调整Mg2+浓度、酶量、扩增程序。d）、模板质粒质量偏差：长期放置、反复冻融会导致模板质粒断裂、开环或降解， 应使用新鲜制备的质粒作为模板。2）、平板上长不出克隆或克隆数目很少a）、感受态效率低：使用新制备或妥善冻存的感受态细胞，确保转化效 率107cfu/pg。每次可设置一组转化质粒的对照实验，以检测感受态细胞的转化 效率。b）、重组反应体系中DNA量不足，或者比例不佳（双碱基突变）：尽量按照推荐DNA 的量配制反应体系。请务必预先检测DpnI消化产物的浓度。常用的吸光度测量法 极易受DNA纯度、DNA稀释液pH等因素影响，测定值和DNA实际浓度往往偏差 非常大。因此，我们强烈推荐您通过琼脂糖电泳来测定样品中的DNA浓度。c）、重组环化反应体系中DNA不纯，抑制反应：未纯化DpnI消化产物加入重组反 应体系内的总体积不应超过4四1 （反应体系体积1 /5）。尝试对DpnI消化产物进行胶 回收纯化。d）、感受态细胞中加入了过多的反应产物：反应产物的转化体积不应超过感受态 细胞体积的1/10，否则会降低转化效率。e）、出现转化抑制效应：当转化SDNA浓度太高时，会抑制转化反应。将重组反 应产物稀释5倍后取1 /5进行转化。3）、定点突变未正确完成a）、引物设计错误：核对引物设计方案。b）、扩增反应所用模板为非甲基化的质粒：DpnI只能识别甲基化DNA，请务必使 用从甲基化酶无缺陷的宿主菌中扩增的质粒作为PCR模板。c）、扩增反应使用过多的模板质粒：对于大多数质粒，1 ng模板量已足以使扩增 反应正常进行，过多的质粒模板将会导致Dpn I消化不完全，降低突变成功率。4）、非目标位点突变a）、模板质粒携带未知位点突变：测序确认模板质粒序列正确性。b）、扩增循环数过多：为了防止扩增过程中引入非目标突变，扩增循环数不宜超 过35。如果扩增效率良好的话，推荐扩增循环数应不超过30。5）、弓|物Tm值过高a）、计算引物退火温度时，应计算待突变位点至引物3端这一区域内的碱基，待 突变位点至引物5端区域内的碱基不应参与计算。