微生物研究进展chapter5分子生态学方法在环境微生物研究领域的应用

第五章第五章 分子生态学方法在分子生态学方法在环境环境 微生物微生物研究领域的应用研究领域的应用农学农学系生物技系生物技术专业课术专业课程程微生物微生物学研学研究究进进展展一、微生物分子生态学的理论一、微生物分子生态学的理论二、微生物分子生态学的研究方法二、微生物分子生态学的研究方法三、展望三、展望墨西哥湾墨西哥湾“深海地平线深海地平线”钻油台钻油台2010年年4月月20日爆炸起火沉没后不断漏油。钻油台所日爆炸起火沉没后不断漏油。钻油台所属的英国石油公司近日宣布又发现一处泄漏点，令漏油量多达每日属的英国石油公司近日宣布又发现一处泄漏点，令漏油量多达每日5000桶，是原先桶，是原先估计的估计的5倍，并正逼近美南部倍，并正逼近美南部4个州的海岸。个州的海岸。1、传统培养法的瓶颈、传统培养法的瓶颈 微生物多样性被用于监视和预测环境变化微生物多样性被用于监视和预测环境变化,也是新也是新基因资源的重要来源。传统纯培养技术虽然已经帮助人基因资源的重要来源。传统纯培养技术虽然已经帮助人们认识了很多微生物，创造了巨大的财富，但是由于们认识了很多微生物，创造了巨大的财富，但是由于 什么原因？什么原因？各种环境中能纯培养的微生物种类非常有限，各种环境中能纯培养的微生物种类非常有限，远远远远不能反映出自然界微生物多样性的不能反映出自然界微生物多样性的丰度和范围丰度和范围。一、微生物分子生态学的理论一、微生物分子生态学的理论2、微生物分子生态学的产生、微生物分子生态学的产生 为了为了突破传统纯培养方法的限制突破传统纯培养方法的限制，必须要，必须要有一种能有一种能绕过纯培养绕过纯培养这一步的新技术，来这一步的新技术，来推动微生物多样性的研究。推动微生物多样性的研究。微生物分子生态学的产生使得微生物微生物分子生态学的产生使得微生物群落群落的的研究研究由细胞水平深入到分子机制研究水平由细胞水平深入到分子机制研究水平,提出了提出了微生物分子进化微生物分子进化和和分子适应分子适应等全新概等全新概念念,使微生物生态学理论更加接近自然本质。使微生物生态学理论更加接近自然本质。3、微生物分子生态学的概念、微生物分子生态学的概念 利用利用分子生物学技术分子生物学技术手段研究自然界手段研究自然界微生物与微生物与生物及非生物环境生物及非生物环境之间之间相互关系及其相互作用规律相互关系及其相互作用规律的科学。的科学。主要研究微生物区系主要研究微生物区系组成组成、结构结构、功能功能、适应适应性发展性发展及其及其分子机制分子机制等微生物生态学基础理论问题。等微生物生态学基础理论问题。墨西哥湾墨西哥湾“深海地平线深海地平线”钻油台钻油台2010年年4月月20日爆炸起火沉没后不断漏油。钻油台所日爆炸起火沉没后不断漏油。钻油台所属的英国石油公司近日宣布又发现一处泄漏点，令漏油量多达每日属的英国石油公司近日宣布又发现一处泄漏点，令漏油量多达每日5000桶，是原先桶，是原先估计的估计的5倍，并正逼近美南部倍，并正逼近美南部4个州的海岸。个州的海岸。环境微环境微生物群生物群落落微生物代谢微生物代谢生理学方法生理学方法生物化学生物化学方法方法分子生物分子生物学方法学方法呼吸醌指纹法呼吸醌指纹法 脂肪酸指纹法脂肪酸指纹法PLFABIOLOG法法杂交法杂交法基于基于16SrDNA方法方法宏基因组宏基因组核酸探针杂交核酸探针杂交荧光原位杂交荧光原位杂交FISH16S rDNA克隆文库克隆文库DGGE/TGGESSCPT-RFLP、ARDRA RFLP、RISARADP、ERIC等等基因芯片技术基因芯片技术二、微生物分子生态学的研究方法二、微生物分子生态学的研究方法1、研究路线、研究路线分析分析方法方法方法方法类别类别原理原理优点优点缺点缺点分子分子杂交杂交核酸核酸探针探针杂交杂交DNADNA的变性、复性及其的变性、复性及其在复性过程中的碱基在复性过程中的碱基配对原则、探针与配对原则、探针与靶分子的特异性结合靶分子的特异性结合过程简单过程简单避免避免PCRPCR偏差偏差影响杂交分析结果的影响杂交分析结果的因素复杂，因素复杂，只能用来只能用来检测事先已知其目标检测事先已知其目标基因序列的微生物基因序列的微生物FISHFISH人工合成的荧光或放射人工合成的荧光或放射性标记探针与微生性标记探针与微生物基因组杂交物基因组杂交操作简单，操作简单，可原位检测可原位检测，检测灵敏度高检测灵敏度高只能对特定类群的只能对特定类群的微生物进行研究微生物进行研究其它其它分子分子生物生物学学方法方法RFLPRFLP序列差异引起限制性内序列差异引起限制性内切酶切酶 酶切位点酶切位点的差异的差异信息量大信息量大重复性高重复性高周期长，过程繁琐周期长，过程繁琐RAPDRAPD利用随意设计的利用随意设计的非特异引物非特异引物简单、迅速简单、迅速重复性低重复性低ERICERIC肠杆菌基因间重复共有肠杆菌基因间重复共有序列在不同种属或序列在不同种属或者同属的不同种微生物者同属的不同种微生物之间的拷贝数和定之间的拷贝数和定位的差异引起两个位的差异引起两个ERICERIC之间序列的多态性之间序列的多态性结果稳定结果稳定重复性好重复性好灵敏度高灵敏度高PCRPCR反应本身的扩增和反应本身的扩增和偏差可能会产生假偏差可能会产生假阳性，阳性，不能对群落中不能对群落中感兴趣的菌进一步研究感兴趣的菌进一步研究分析分析方法方法方法方法类别类别原理原理优点优点缺点缺点基于基于16S16SrDNArDNA的的方法方法16S16SrDNArDNA克隆克隆文库文库可以用来揭示可以用来揭示不同物种的不同物种的系统进化关系系统进化关系反映各种微反映各种微生物种类构成生物种类构成和亲缘关系和亲缘关系工作量大，成本高，不工作量大，成本高，不能对目标种群进行能对目标种群进行原位和实时的检测原位和实时的检测DGGEDGGE不同的不同的变性剂变性剂浓浓度，解链之后电泳速度度，解链之后电泳速度将会急剧下降将会急剧下降DNADNA片段纯化片段纯化后可以直接后可以直接用于测序用于测序分辨率低，分辨率低，被分析的片被分析的片段不能大于段不能大于400bp400bpTGGETGGE温度梯度温度梯度，利用不同序，利用不同序列结构的列结构的DNADNA，双链，双链具有不同的熔点温度具有不同的熔点温度TmTm同上同上同上同上SSCPSSCP长度相同但长度相同但序列不同的序列不同的单链单链DNADNA具有空间构具有空间构象上的差异象上的差异操作比较简便操作比较简便价格低廉价格低廉灵敏度和重现度差，灵敏度和重现度差，150150400bp400bp最佳最佳的分离效果的分离效果ARDRAARDRA16S rDNA16S rDNA序列的差异，序列的差异，限制性核酸内切酶酶切限制性核酸内切酶酶切后将得到长度与数量后将得到长度与数量不同的不同的DNADNA片段片段分辨率高分辨率高对图谱进行定量化解析对图谱进行定量化解析和进行群落和进行群落间的比较都十分困难间的比较都十分困难T-T-RFLPRFLPPCRPCR扩增中所用引物的扩增中所用引物的一端或两端带有一端或两端带有荧光荧光标记标记方便快捷方便快捷分辨率高分辨率高灵敏度高灵敏度高复杂群落多样性的低估、复杂群落多样性的低估、影响因素多、影响因素多、无法对微生物定性分析无法对微生物定性分析RISARISA核糖体区间序列多态性核糖体区间序列多态性操作简单、序操作简单、序列多态性丰富列多态性丰富核糖体的拷贝数的不同核糖体的拷贝数的不同会产生假阳性会产生假阳性2 2、荧光原位杂交（、荧光原位杂交（FISH FISH）利用利用生物素或地高辛等非放射性物质生物素或地高辛等非放射性物质标记探针，并标记探针，并通过荧光直接标记或者荧光素偶联的抗原通过荧光直接标记或者荧光素偶联的抗原-抗体检抗体检测系统，对测系统，对DNADNA或或RNARNA进行定性或定位分析进行定性或定位分析。2 2、基于、基于16S rDNA16S rDNA的指纹图谱法的指纹图谱法为什么选择为什么选择16S rRNA16S rRNA基因作为微生物进化基因作为微生物进化的遗传标记的遗传标记?方法：方法：16S rDNA 16S rDNA克隆文库克隆文库 /ARDRA/ARDRA DGGE/TGGE DGGE/TGGE RFLP/T-RFLP RFLP/T-RFLP RISA RISA（ITSITS）SSCPSSCP 构建构建16S rDNA16S rDNA克隆文库克隆文库环境样品环境样品 提基因组提基因组扩增混合基因扩增混合基因组组16SrDNA与载体连接，转与载体连接，转入感受态细胞入感受态细胞微生物群落微生物群落 结构信息结构信息 挑取单克隆鉴定挑取单克隆鉴定是否为阳性克隆是否为阳性克隆酶切、酶切、PCR方法方法鉴定鉴定全部阳性克隆测序全部阳性克隆测序与数据库与数据库序列比对序列比对系统发系统发育分析育分析阳性克隆鉴定阳性克隆鉴定PCR扩增所有扩增所有16SrDNA片段片段两种或两种以上四碱两种或两种以上四碱基限制性内切酶酶切基限制性内切酶酶切内切酶图谱分型内切酶图谱分型每种类型挑选每种类型挑选1-31-3个个 克隆测序克隆测序 序列比对及分析序列比对及分析由于由于载体与载体与DNADNA片段一一对应片段一一对应，可得到单个可得到单个DNADNA片段重组质粒，片段重组质粒，转化时过程中绝大多数感受态转化时过程中绝大多数感受态细胞只能接受一个外源细胞只能接受一个外源DNADNA分子，分子，由此便可达到把混合片段分开由此便可达到把混合片段分开的目的的目的ARDRA优点优点得到的序列信息比较完整得到的序列信息比较完整片段携带的信息量大，结果可靠片段携带的信息量大，结果可靠 适合对环境中微生物群落的整体结构进行分析适合对环境中微生物群落的整体结构进行分析 缺点缺点工作量大工作量大不能对目标种群进行原位和实时监测不能对目标种群进行原位和实时监测Vinh D.Pham等人用等人用16S rDNA文库结合文库结合fosmid方法研究方法研究了阿拉斯加某中温油藏采出水中了阿拉斯加某中温油藏采出水中细菌和古细菌的多样性细菌和古细菌的多样性，结，结果表明古细菌和细菌数量均等，果表明古细菌和细菌数量均等，未培养微生物约占检出总量未培养微生物约占检出总量的的30%左右左右，检测到的古细菌主要是乙酸型产甲烷古菌检测到的古细菌主要是乙酸型产甲烷古菌。佘跃惠等人也用佘跃惠等人也用16S rDNA文库结合文库结合TGGE方法研究了大港方法研究了大港孔店油田注水油藏微生物群落的多样性，孔店油田注水油藏微生物群落的多样性，结果表明结果表明注水井中注水井中的微生物多样性比采油井中丰富的微生物多样性比采油井中丰富，注水井样品中的细菌主要，注水井样品中的细菌主要属于变形菌门和放线菌纲属于变形菌门和放线菌纲,尤其是红细菌亚纲尤其是红细菌亚纲(47%)。采油井。采油井样品的细菌主要属于变形菌门样品的细菌主要属于变形菌门,尤其是假单胞菌属尤其是假单胞菌属(62%)。通常采用通常采用构建构建16SrDNA文库方法与其它分子生物学方法联文库方法与其它分子生物学方法联合合，对环境微生物群落结构进行分析。，对环境微生物群落结构进行分析。16S rDNA16S rDNA克隆文库数据分析克隆文库数据分析 根据不同的酶切图谱分型后，根据不同的酶切图谱分型后，可以得到该可以得到该环境样品中的微生物组成环境样品中的微生物组成信息信息。同时，根据每一个。同时，根据每一个OTUOTU所含的克隆数目，也可以推测出该所含的克隆数目，也可以推测出该环境中的环境中的优势菌群优势菌群。OTUsMatch_Nameclone numberthe ratio of all clonesgenusOTU1Methanosaeta thermophila PT3427.42%甲烷鬃菌属甲烷鬃菌属OTU2Methanolinea tarda43.23%甲烷绳菌属甲烷绳菌属OTU3Uncultured archaeon 10.81%未培养古菌未培养古菌OTU4Uncultured archaeon10.81%未培养古菌未培养古菌OTU5Uncultured archaeon54.03%未培养古菌未培养古菌OTU6Uncultured archaeon75.65%未培养古菌未培养古菌 OTU7Uncultured archaeon 118.87%未培养古菌未培养古菌 OTU8Uncultured archaeon10.81%未培养古菌未培养古菌 OTU9Uncultured euryarchaeote10.81%未培养牛瘤胃古菌未培养牛瘤胃古菌 OTU10Uncultured Methanosarcinales5241.94%甲烷八叠球菌属甲烷八叠球菌属OTU11Uncultured euryarchaeote clone 10.81%未培养牛瘤胃古菌未培养牛瘤胃古菌OTU12Uncultured crenarchaeote21.61%泉古菌门泉古菌门OTU13Uncultured Methanosaeta sp.10.81%甲烷鬃菌属甲烷鬃菌属OTU14Uncultured archaeon 21.61%未培养古菌未培养古菌OTU15Uncultured archaeon 10.81%未培养古菌未培养古菌 以大庆油以大庆油田采出水田采出水样品古菌样品古菌文库为例文库为例：变性梯度凝胶电泳变性梯度凝胶电泳DGGE产生产生：1979年由年由Fisher和和Lerman最先提出的用于最先提出的用于检测检测DNA片段中的点突变片段中的点突变的一种电泳技术的一种电泳技术原理原理：碱基组成不同碱基组成不同DNA序列，其解链温度也各不相同。序列，其解链温度也各不相同。由此，便可通过设定不同的变性条件（由此，便可通过设定不同的变性条件（变性剂浓度变性剂浓度或或者温度）将不同的者温度）将不同的DNA片段分开。片段分开。特点特点：分离大小相同，但碱基组成不同的序列分离大小相同，但碱基组成不同的序列16S rDNA16S rDNA的高可变区的高可变区E.coli 16S rRNA二级结构及各可变区二级结构及各可变区 V3 V3区区 约约170bp170bp V6-V8 V6-V8区区 约约350bp350bp 片段大小不同，携带的片段大小不同，携带的信息量不同，选择不同的信息量不同，选择不同的区域得到区域得到DGGEDGGE图谱不同，图谱不同，群落信息也有差异群落信息也有差异 不同的片段大小对应的不同的片段大小对应的胶浓度也不同胶浓度也不同根据需要选择最合适的根据需要选择最合适的提取基因组后，扩增提取基因组后，扩增16SrDNA高可变区高可变区片段片段确定合适的变性剂范围对DNA片段进行有效分离根据根据变性剂梯度方向与电泳方向变性剂梯度方向与电泳方向相同或不相同或不同同,DGGE分为：分为：垂直垂直DGGE 平行平行DGGEGC-ClampGC-Clamp 调节目的序列的解链行为，为一段调节目的序列的解链行为，为一段40bp40bp的高的高GCGC含量的片段含量的片段 常规的常规的DGGEDGGE电泳技术对于长度超过电泳技术对于长度超过500bp500bp的的DNADNA片段的序列变化情况片段的序列变化情况,只能有只能有50%50%的检出率。的检出率。应用应用“GCGC夹板夹板”技术可使检出率提高到技术可使检出率提高到100%100%。当当等长的双链等长的双链DNADNA分子分子在含梯度变性剂在含梯度变性剂(尿素、甲酰胺尿素、甲酰胺)聚丙烯聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳时酰胺凝胶中进行电泳时,因其因其解链的速度和程度解链的速度和程度与其序列密切相关与其序列密切相关;部分解链的部分解链的DNADNA分子的分子的迁移速度随解链程度增迁移速度随解链程度增大而减小大而减小。GC-Clamp16SrDNA低低浓浓度度高高浓浓度度DGGE的参数：的参数：胶浓度胶浓度 取决于片段大小取决于片段大小 ，通常不宜超过，通常不宜超过500bp500bp 6%6%胶浓度：胶浓度：400 400 1000bp1000bp 8%8%胶浓度：胶浓度：200 200 400bp400bp 10%10%胶浓度：胶浓度：100 100 300bp300bp 变性剂范围变性剂范围 不同的样品不同不同的样品不同 温度温度 一般都用一般都用6060摄氏度摄氏度 电压电压 时间时间环境样品分析的流程环境样品分析的流程DGGEDGGE在微生物分子生态学中的应用在微生物分子生态学中的应用 对微生物对微生物群落结构群落结构进行对比、分析或者跟踪监测。进行对比、分析或者跟踪监测。通过扩增通过扩增功能基因功能基因来研究功能基因及功能菌群的来研究功能基因及功能菌群的 多样性。多样性。跟踪及检测细菌的富集和分离跟踪及检测细菌的富集和分离，评价不同的培养，评价不同的培养 条件对分离菌种的影响。条件对分离菌种的影响。举例：举例：油藏古细菌油藏古细菌 V3V3区区 DGGE DGGE 图谱图谱胶浓度：胶浓度：10%10%变性剂范围：变性剂范围：40%-60%40%-60%电压：电压：200V200V运行时间：运行时间：4.5h4.5h优点优点：缺点缺点：分辨率有限，复杂环境中（土壤或肠道），分辨率有限，复杂环境中（土壤或肠道），只能检测出优势菌。只能检测出优势菌。一般只能分析一般只能分析500bp以下以下的片段。的片段。PCR过程产生的过程产生的异源双链和单链异源双链和单链DNA会对分析造成偏差。会对分析造成偏差。RFLP（限制性片段长度多态性限制性片段长度多态性）探针：探针：限制性内切酶限制性内切酶：Hind、BamH、EcoR、EcoRV、Xba等。等。优点优点遍布整个基因组，数据多态信息量大遍布整个基因组，数据多态信息量大结果非常稳定，重复性好，探针多结果非常稳定，重复性好，探针多缺点缺点技术复杂，周期长，费用高技术复杂，周期长，费用高检测中需放射性物质，限制了广泛应用检测中需放射性物质，限制了广泛应用DNADNA量大，分析速度慢量大，分析速度慢T-RFLPT-RFLP（末端限制性片段长度多态性）（末端限制性片段长度多态性）每个荧光峰至少代表一个细菌或几个近缘的细菌每个荧光峰至少代表一个细菌或几个近缘的细菌 每个峰面积占总峰面积的百分数代表这个末端限制性片段的相对数量，可粗每个峰面积占总峰面积的百分数代表这个末端限制性片段的相对数量，可粗略认为与细菌在某一部位的微生态群落中的相对数量略认为与细菌在某一部位的微生态群落中的相对数量T-RFLP的优点的优点：相对于其它方法，相对于其它方法，T-RFLP技术技术分析分析更为迅速，且结果可以数据的形式输出更为迅速，且结果可以数据的形式输出，因而在微生物群落的快速检测和分析中更因而在微生物群落的快速检测和分析中更有优势。有优势。分析分析方法方法方法方法类别类别原理原理优点优点缺点缺点基于基于16S16SrDNArDNA的的方法方法16S16SrDNArDNA克隆克隆文库文库可以用来揭示可以用来揭示不同物种的不同物种的系统进化关系系统进化关系反映各种微反映各种微生物种类构成生物种类构成和亲缘关系和亲缘关系工作量大，成本高，不工作量大，成本高，不能对目标种群进行能对目标种群进行原位和实时的检测原位和实时的检测DGGEDGGE不同的不同的变性剂变性剂浓浓度，解链之后电泳速度度，解链之后电泳速度将会急剧下降将会急剧下降DNADNA片段纯化片段纯化后可以直接后可以直接用于测序用于测序分辨率低，分辨率低，被分析的片被分析的片段不能大于段不能大于400bp400bpTGGETGGE温度梯度温度梯度，利用不同序，利用不同序列结构的列结构的DNADNA，双链，双链具有不同的熔点温度具有不同的熔点温度TmTm同上同上同上同上SSCPSSCP长度相同但长度相同但序列不同的序列不同的单链单链DNADNA具有空间构具有空间构象上的差异象上的差异操作比较简便操作比较简便价格低廉价格低廉灵敏度和重现度差，灵敏度和重现度差，150150400bp400bp最佳最佳的分离效果的分离效果ARDRAARDRA16S rDNA16S rDNA序列的差异，序列的差异，限制性核酸内切酶酶切限制性核酸内切酶酶切后将得到长度与数量后将得到长度与数量不同的不同的DNADNA片段片段分辨率高分辨率高对图谱进行定量化解析对图谱进行定量化解析和进行群落和进行群落间的比较都十分困难间的比较都十分困难T-T-RFLPRFLPPCRPCR扩增中所用引物的扩增中所用引物的一端或两端带有一端或两端带有荧光荧光标记标记方便快捷方便快捷分辨率高分辨率高灵敏度高灵敏度高复杂群落多样性的低估、复杂群落多样性的低估、影响因素多、影响因素多、无法对微生物定性分析无法对微生物定性分析RISARISA核糖体区间序列多态性核糖体区间序列多态性操作简单、序操作简单、序列多态性丰富列多态性丰富核糖体的拷贝数的不同核糖体的拷贝数的不同会产生假阳性会产生假阳性分析分析方法方法方法方法类别类别原理原理优点优点缺点缺点分子分子杂交杂交核酸核酸探针探针杂交杂交DNADNA的变性、复性及其的变性、复性及其在复性过程中的碱基在复性过程中的碱基配对原则、探针与配对原则、探针与靶分子的特异性结合靶分子的特异性结合过程简单过程简单避免避免PCRPCR偏差偏差影响杂交分析结果的影响杂交分析结果的因素复杂，因素复杂，只能用来只能用来检测事先已知其目标检测事先已知其目标基因序列的微生物基因序列的微生物FISHFISH人工合成的荧光或放射人工合成的荧光或放射性标记探针与微生性标记探针与微生物基因组杂交物基因组杂交操作简单，操作简单，可原位检测可原位检测，检测灵敏度高检测灵敏度高只能对特定类群的只能对特定类群的微生物进行研究微生物进行研究其它其它分子分子生物生物学学方法方法RFLPRFLP序列差异引起限制性内序列差异引起限制性内切酶切酶 酶切位点酶切位点的差异的差异信息量大信息量大重复性高重复性高周期长，过程繁琐周期长，过程繁琐RAPDRAPD利用随意设计的利用随意设计的非特异引物非特异引物简单、迅速简单、迅速重复性低重复性低ERICERIC肠杆菌基因间重复共有肠杆菌基因间重复共有序列在不同种属或序列在不同种属或者同属的不同种微生物者同属的不同种微生物之间的拷贝数和定之间的拷贝数和定位的差异引起两个位的差异引起两个ERICERIC之间序列的多态性之间序列的多态性结果稳定结果稳定重复性好重复性好灵敏度高灵敏度高PCRPCR反应本身的扩增和反应本身的扩增和偏差可能会产生假偏差可能会产生假阳性，阳性，不能对群落中不能对群落中感兴趣的菌进一步研究感兴趣的菌进一步研究三、展望三、展望 使用微生物分子生态学方法，绕过了纯培养的瓶使用微生物分子生态学方法，绕过了纯培养的瓶颈，可以颈，可以普遍的、定量的、系统的普遍的、定量的、系统的描述微生物的描述微生物的多样性，从而能够以多样性，从而能够以相对无偏见的方式相对无偏见的方式了解环境了解环境中的微生物及其生态系统。中的微生物及其生态系统。存在的问题：存在的问题：环境样品在提取核酸前环境样品在提取核酸前,无论是厌氧或是室温存放，无论是厌氧或是室温存放，样品样品 中的微生物仍不可避免的发生一些变化中的微生物仍不可避免的发生一些变化。每次提取每次提取DNADNA的效率不同的效率不同,影响结果的影响结果的重复性重复性;提取核酸时提取核酸时,细胞的裂解程度不均一细胞的裂解程度不均一;引物对样品中不同微生物核酸扩增效率引物对样品中不同微生物核酸扩增效率不同不同;在真核微生物生态学的分析上还是比较少在真核微生物生态学的分析上还是比较少。现在，微生物分子生态学研究已经超越了现在，微生物分子生态学研究已经超越了单纯说明环单纯说明环境微生物群落结构境微生物群落结构的阶段；的阶段；重心转移到了重心转移到了群落功能方面群落功能方面的研究，一方面要求的研究，一方面要求深入深入挖掘已有方法的潜力挖掘已有方法的潜力，另一方面也，另一方面也尝试着多种方法的尝试着多种方法的联合联合，最终分析清楚各种微生物在生态系统中发挥的最终分析清楚各种微生物在生态系统中发挥的作用作用，将微生物群落结构和群落功能联系起来将微生物群落结构和群落功能联系起来。这也是微生物分子生态学研究的这也是微生物分子生态学研究的。