IgY提取纯化方法

IgY提取纯化方法鸡卵黄中含有水分48.0%，蛋白质17.8%和脂肪30.5%，其中大部分脂肪与结合以脂蛋白的形式存在。卵黄包括水溶性蛋白丫-卵黄球蛋白，a-卵黄球蛋白，B-卵黄球蛋白。丫-卵黄球蛋白和各种脂，如LDL、HDL等。所以分离纯化IgY的关键是除去卵黄中高含量的脂及脂蛋白。早在20世纪60年代初，科学家就发现鸡卵黄中存在IgG抗体，其含量与血清相似甚至更高，但一直未引起足够的重视，显然是由于很难将IgG抗体从丰富的卵黄脂质中分离出来，使得鸡蛋作为抗体来源的研究受到限制。直到80年代初，Polson和Jensenius相继建立了有效且相对简便的聚乙二醇（PEG）提取法和硫酸葡聚糖提取法，有关这方面的研究便如雨后春笋般大量涌现，并且被广泛应用在生物学的许多领域。1 IgY的分离分离的关键是除去卵黄中高含量的脂肪及脂蛋白，以获得水溶性组分（WaterSolubleFraction,WSF）。常见分离方法有以下几种：1.1有机物沉淀法聚乙二醇（PEG）法和硫酸葡聚糖（DS）法是比较常用的方法。一般采用PBS或TBS作缓冲液，将卵黄液稀释5倍，加入一定比例的聚乙二醇6000（以3.5%最佳）或硫酸葡聚糖，脂类即发生沉淀，IgY保留在上清液中。SchwarzkopfC等在比较了6种分离方法后认为硫酸葡聚糖法具有快速、有效、简便等优点。1.2 有机溶剂抽提法脂类易溶于有机溶剂，可采用氯仿等进行分离。一个经TBS冲洗过的鸡蛋黄制成15mL蛋黄液，加入40mLTBS充分混合后加入40mL氯仿，冷冻离心，分三相。弃去氯仿层，保留水层，中间的半固体相用40mLTBS萃取，取水层，与前一步水层合并即为水溶性组分Hamada将蛋黄溶于等体积的盐溶液中，再与二倍体积的氯仿混合，离心即得水溶性组分。还有学者使用丙酮分离获得水溶性组分。天然胶法Hatta等认为一些天然胶如卡拉胶和黄原胶可用于卵黄抗体分离。具体做法是将9倍体积的0.1%（w/v）卡拉胶溶液与卵黄混合，离心得水溶性组分。亦可将卵黄用双蒸水稀释一倍后与4倍体积的黄原胶混合，离心得水溶性组分。使用天然胶法去除脂类比较完全，水溶液中脂类含量少于0.4%。1.3 中链脂肪酸法用于卵黄抗体分离的中链脂肪酸是指含8-10个碳原子的饱和脂肪酸，常用的是辛酸。鸡卵黄用去离子水稀释7.5倍，混合，离心，上清液再用醋酸盐缓冲液稀释2倍，pH值5.0,加辛酸至浓度为1%,静置分层，IgY在水层中。这一方法的关键在于卵黄的稀释。Mclaren也采用了类似的方法，但稀释倍数、pH不相同。1.4 去污剂分离法一些表面活性剂主要是去污剂可分离卵黄抗体。有些学者比较了几种去污剂包括阴离子、阳离子和非离子型去污剂，发现用溴化十六烷基三甲铵进行分离，脂类的残留量不足3%,而用十二烷基磺酸钠分离残留量最高，为14%35%。用非离子型去污剂辛苯聚醇-8(TRITON.RTM.X-114)分离时，蛋白回收率可达85%95%。鸡卵黄用TBS稀释20倍，离心，取上清液加6%TX-114，搅拌，升温至37C,混合物分层，脂类在去污剂相，IgY在水相中。Stallberg用TX-100分离，蛋白回收率可达97%。泊洛沙姆对鸡卵黄具有良好的脱脂作用，并且具有脂类自然沉降速度快、对抗体影响小、简化工艺以及本身无毒、无害的特点，适合于卵黄的综合开发利用2。1.6水稀释法Akita提出了水稀释法，将卵黄用水稀释10倍，调pH值到5.2,4C静置6h,上清液即为水溶性组分。也可采用7倍水稀释卵黄。水稀释法工艺简便，采用适当的方法进行纯化，回收率和纯度都很高。1.7超临界气体提取法该法和前面所述方法的主要不同在于不是将卵黄先稀释，而是首先通过喷雾干燥获得卵黄粉末。所得卵黄粉末通过超临界提取法去除脂类。其原理是在高压下二氧化碳液化，将卵黄中的脂溶性物质溶解在其中，并随气流带走。将卵黄粉末装人超临界气体抽提装置中，通入300kg/cm2、40C二氧化碳超临界气体与卵黄粉末混合，在60kg/cm2、40C的减压条件下，被抽提出的杂质与超临界气体分开而进入分离室，即得到除去脂肪的卵黄粉末。将去脂的卵黄粉末溶于20倍磷酸缓冲液中，搅拌、离心，即得水溶性组分。2 IgY提纯提取的目的是将大量IgY从水溶液中分离出来，得卵黄抗体9。主要通过超滤法或沉淀法来完成。沉淀法所用的沉淀剂可以是无机物、有机物或有机溶剂，也可以采用多种方法联合沉淀，或沉淀法和超滤法相结合提取。2.1 超滤法超滤法具有浓缩、除盐、分级和纯化作用，使待分离的混合液通过超滤膜，有目的地除去杂质，保留所需部分。IgY的分子质量是180kD,在提取时一般采用的超滤膜分子质量截止值是100kDoAkita在水稀释法分离后经硫酸钠沉淀，超滤，IgY回收率为9.8mg/mL蛋黄，纯度94%10。无机物沉淀法向含有IgY的水溶液中加入无机盐或无机盐的过饱和溶液，使IgY在高盐条件下沉淀出来。常用的盐有硫酸钠和硫酸铵。Ntakarutimana采用氯仿抽提后，水层经10%和36%硫酸钠两次沉淀，最后采用亲和层析进行纯化。Svendsen等比较了硫酸铵盐析法、聚乙二醇法和辛酸法，认为硫酸铵盐析法的IgY回收率为61%，纯度94%，在三种方法中最高。康亦兼等8将卵黄稀释后，取上清液冷冻干燥得粗分离的IgY，再经60%硫酸铵沉淀一次，14%硫酸钠沉淀两次，获得的IgY不需进一步纯化回收率为94%，纯度97%。也可用氯化镁等无机物进行沉淀。采用无机盐沉淀后所得固体，一般需经膜透析除去残留盐分。2.3有机溶剂沉淀法Polson的PEG法采用终浓度为3.5%的PEG6000对卵黄进行分离获得水溶性组分，用12%PEG进行沉淀，沉淀经磷酸盐缓冲液溶解后再用12%PEG沉淀，得IgY。1985年Polson对此方法加以改进，先后经12%PEG和-20C的50%乙醇两步沉淀法获得IgY，回收浓度4.9mg/mL蛋黄，纯度89%。也可采用冷乙醇两步沉淀法从水溶性组分中分离IgY。IgY的提取一般采用联合沉淀法，即用不同的沉淀剂对水溶性组分经过两次或多次沉淀，从而获得纯度较高的IgY11。除前面介绍的方法外还有使用聚乙二醇8000和硫酸铵、硫酸钠和辛酸、硫酸铵和乙醇等联合沉淀的方法。3 IgY纯化为了满足不同使用目的，大多数情况下需对提取得到的卵黄抗体进一步纯化，除去其中的杂蛋白、盐、沉淀剂或其他杂质，获得高纯度的IgY，目前主要采用层析方法。3.l凝胶过滤层析凝胶过滤也叫分子筛层析。它主要利用具有网状结构的凝胶分子筛作用，根据被分离物的分子大小不同来进行。在对IgY纯化时常用交联葡聚糖做凝胶层析介质。Hassl等对PEG法分离获得的卵黄抗体采用疏水层析和凝胶过滤两步法纯化，产物纯度较高。lmL含58mg卵黄抗体的稀释液，经过以上步骤处理后，卵黄抗体含量依次降至3.5、4.7和1.2mg。该法与PolsonPEG法相比，所得产物纯度和抗体活性均相似，但收率较低。这可能是由于经过两次层析的缘故。3.2离子交换层析离子交换层析是利用离子交换剂对各种离子亲和力不同，借以分离混合物中各种离子的一种层析法。生物大分子和离子交换剂之间的相互作用主要是静电作用，导致介质表面的可交换离子与带相同电荷的蛋白质分子发生交换。IgY多以葡聚糖交联的弱碱性阴离子交换剂DEAE为载体，磷酸盐缓冲液为吸附洗脱体系进行分离纯化。Hatta用DEAE-Sephacel柱层析得到98%IgY，每个鸡蛋黄得70-100mgIgY。陈天豹等12采用DEAE-TOY-OPEAL650M进行一步洗脱得电泳纯IgY，总蛋白回收率93.44%。由于离子交换层析的介质材料及含盐缓冲流动体系类似于蛋白质稳定存在的生理条件，有利于增加活性蛋白回收率。3.3 亲和层析亲和层析是利用生物大分子和配体间专一性亲和力而设计的层析技术。蛋白质、酶等生物大分子和小分子配体在一定条件下能紧密结合成复合物。如将复合物中某一方固定在不溶性载体上，则可以从溶液中专一性地分离和提纯另一方。从理论上讲，能产生一个绝对的纯化作用，因此可达到很高的纯度。在IgY的纯化中采用亲和层析法根据配体的不同有以下几种。3.3.1嗜硫性亲和层析也称亲硫层析。该法所用吸附剂称T胶，制备方法为：琼脂糖凝胶（SephroseCL-4B在pH12的条件下用二乙烯砜激活，再在pH11的条件下与2巯基乙醇反应。依靠活化的琼脂糖上的砜硫醚基团对蛋白质表面适当位点的特异性吸附，能在高盐环境下选择性地结合IgY。也可采用柠檬酸-磷酸二氢钠缓冲液为吸附洗脱体系。傅蓉等13采用嗜硫性色谱法一步分离纯化IgY，蛋白回收率91.26%，活性回收率达70%，IgY为电泳纯，该法的IgY回收率可达99%。3.3.2固相金属离子亲和层析固相金属离子亲和层析常用的金属离子有Cu2+、Ni2+、Co2+、Zn2+等，GreeneCR等研究表明Fe3+与磷酸化氨基酸有很强的亲和力。用亚氨乙酰乙酸（IDA）活化的琼脂糖6B装柱，然后用FeCl3.H2O将其转化成IDA-Fe3+，加入IgY提取液，经pH梯度洗脱。基于不同pH有4个洗脱峰，IgY经纯化得4个亚群14。该法可用于大规模工业化生产。由以上可以看出，在很多情况下经过分离和提取就可以得到纯度较高的卵黄抗体。衡量一个方法的好坏要考虑到分离、提取和纯化的全过程，并从工艺路线长短、工艺条件难易以及回收率和纯度等方面综合评价。从工艺路线上看水稀释法、无机物沉淀法、超临界气体提取有机物沉淀法工艺路线较短，而其他方法需两步或更多步获的沉淀；从工艺条件上看有机溶剂沉淀法需-20C冷冻，超临界气体法需要超临界气体抽提设备，对设备要求较高；从原材料成本看，天然胶法采用的是天然胶，成本较高；从回收率和纯度方面看，水稀释法和超临界气体法的产品纯度和回收率都较高。综合考虑，水稀释法具有工艺简便、生产成本较低、产品纯度和回收率高等优点，比较适合大规模工业化生产。