蛋白纯化和GST沉降技术

蛋白纯化和GST沉降技术【原理】细菌表达的谷胱甘肽S 转移酶（GST）融合蛋白主要用于蛋白的亲和纯化, 也可以将 GST 融合蛋白作为探针，与溶液中的特异性搭档蛋白结合，然后根据 谷胱甘肽琼脂糖球珠能够沉淀 GST 融合蛋白的能力来确定相互作用的蛋白。一 般在得到目标蛋白的抗体前,或发现抗体干扰蛋白质蛋白质之间的相互作用 时，可以启用GST沉降技术。该方法只是用于确定体外的相互作用。【应用】1）确定融合（或探针）蛋白与未知（或靶）蛋白间的新的相互作用2）证实探针蛋白与已知蛋白质间可疑的相互作用【方法】一、GST融合蛋白的纯化1、菌种的活化：按1%的量在螺旋管中活化所需菌种，一般50ul的冻存菌接入5ml 的 LB 中，37C 220rpm 培养2、活化的菌种转接1%接种于5mlLB中，37C 220rpm培养至0D0.40.6之 间，即到达对数生长时期（大约 34小时）3、取1ml菌液测定OD值，至0D0.40.6之间，则取诱导前1ml，其余的按 1/1000加入诱导剂IPTG，低温小量诱导30C 200rpm,诱导过夜（小于16hr）4、次日取诱导后1ml，诱导前和诱导后各1ml， 12000rpm ，离心2mins，弃上 清，加适量的1* PBS，重悬菌液，再加1* loading buffer，混匀，沸水煮 10mins, 12000rpm ，离心2mins， SDS-PAGE电泳考马氏亮兰染色5、如果考染结果显示GST融合蛋白（GST-X）诱导出来，则做大量诱导6、 菌种活化后按1%转接种于100ml LB中，30C 200rpm扩大培养至0D0.40.6 之间，即到达对数生长时期（大约 3 小时）7、取1ml菌液测定OD值，至0D0.40.6之间，按1/10000加入诱导剂IPTG， 低温诱导20C 180rpm，制冷系数0.5 ，诱导过夜8、 次日50ml离心管收菌，4C 5000rpm 5mins离心，每瓶100ml重复离心收 于同一离心管中，大型离心机提前预冷9、每 100ml 菌液沉淀加入 10ml A 液重悬10、超声破碎。大探头，冰浴，频率510。超声23s停23s, 1520次一个循环，重新混匀，冰探头，至菌液清亮为止11、超声后的细菌裂解液加入到50ml干净离心管中，4T llOOOrpm 10mins 离心12、平衡 Agrose-beads.每个干净 EP 管中加 50ul Agrose-beads。再加 lml A 液，4C 旋转 23mins 后 4C 3000rpm/600 g 5mins 离心，吸弃 上清，重复 3 次13、吸取菌液离心上清到 50ml 干净离心管，将平衡好的 Agrose -beads 加 入 4C 旋转 4 小时左右14、4C 3000rpm/600 g 10mins 离心。移液管吸弃上清，留有 1ml 左右 时用移液器枪头混匀X-GST-beads,转移至1.5 ml进口 EP管中，用A液 反复洗50ml离心管多次至将全部珠子转移至EP管中。3000rpm/600 g , 5mins,离心，弃上清15、A 液洗涤 X-GST-beads，每次 1ml 4C 旋转 lOmins 后 4C3000rpm/600 g ， 5mins， 离心，吸弃上清，重复 3 次16、最后向X-GST-bead中加入100 ul A液，4C保存17、考染定量：取 2ul GST-beads 加入 10 ul 1* loading buffer 混匀， 沸水煮样 10mins 。 12000rpm 5mins 离心后取上清上样 （SDS-PAGE）。 下胶后，考马氏亮兰染色（新考染液23 mins，旧的考染液1030mins ）, 脱色 2 h 左右二、 GST Pull down1、转染细胞24小时后，IP buffer裂解，超声破碎。大探头，冰浴，频率510。 超声 23s 停 23s, 1520 次一个循环，重新混匀，冰探头，至菌液清亮为止， 12000rpm, 离心 2mins, 取上清作样品，取部分作 In put, 剩下的作 GST Pull down2、根据定量结果取X-GST-beads加入到IP buffer平衡，4C 旋转23mins 后4C 3000rpm/600 g 5mins离心，吸弃上清，重复3次。然后将平衡后 的珠子于600ul cell lysis结合孵育4h过夜3、4C ， 3000rpm/600g ， 5mins 离心后吸回裂解上清， IPbuffer 洗珠子，4C 旋转 10mins 后， 4C 3000rpm/600g 5mins 离心， 23 次。最后用微量上样器将全部 IP buffer 吸弃。4、向 X-GST-beads 其中加入 30 ul 1* loading buffer.细胞裂解液 In put 50 ul 中加入 50 ul 2* loading buffer . 沸水 lOmins 。 12000rpm 5mins 离心后取上清上样进行SDS-PAGE5、电泳后进行Western Blot来确定沉降的蛋白中是否有目的蛋白；也可以将胶 考马氏亮兰染色观察特异沉降的蛋白带，进一步做质谱分析确定沉降的蛋白。【注意事项】1) 该实验设立GST对照，反应均在4C进行2) 沸水煮样以前的离心速度不要超过3000rpm,否则可能将beads离碎了。3) 在检测时如果发现 GST 对照组也有目的蛋白时，则表明有非特异的结合，这是我们应当在GST Pull down的第三步多洗几次。4) GST对照蛋白的量和实验组的蛋白的应该一样，最好是对照的量比实验 组的多一点【举例】GST pull down 验证两种已知蛋白质的相互作用input GSTX-GSTinput GSTY-GSTY-GFP +X-GFP +Anti-GFPAnti-GFP2 免疫共沉淀Cell Lysate or Protein Mixiure$ Coupled Antibortyincubation with Antibody Coupled Resin Antigen二 Ptolein Interactingwith AntigenPin and washElurteAnalyie图 2 免疫共沉淀（ co-IP ）示意图（1）原理1）当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质蛋白质 间的相互作用被保留了下来。如果用蛋白质X的抗体免疫沉淀X,那么与X 在体内结合的蛋白质Y也能沉淀下来。这种方法常用于测定两种目标蛋白质 是否在体内结合,也可用于确定一种特定蛋白质的新的作用搭档 （图2）。2）缺点：可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质蛋白质相互作用（2）方法1）转染后24-48 h 可收获细胞,加入适量细胞裂解缓冲液（含蛋白酶抑制 剂），冰上裂解30min,细胞裂解液于4 C，取少量裂解液以备Western blot分析 做 Input, 剩余的裂解液以最大转速离心 10 min 后取上清，2） 取10p 1 protein A琼脂糖珠，用适量裂解缓冲液（一般1ML/管）平衡3 次,每次 3,000 rpm 离心 5 min,3）将预处理过的10p 1 protein A琼脂糖珠加入到细胞裂解液中4 C缓慢 摇晃孵育lh，进行预沉淀。4）3000rpm 离心后收集上清，将沉淀弃去，上清备用，5）加lp g相应的抗体加入到4）的上清液中，4 C缓慢摇晃孵育lh（也可 过夜），6） 取10p 1 protein A/G琼脂糖珠，用适量裂解缓冲液（一般1ML/管）平 衡3次，每次3,000 rpm离心5 min，7）将预处理过的 10p 1 protein A/G 琼脂糖珠加入到和抗体孵育过的细胞裂 解液中,4 C缓慢摇晃孵育2-4h，使抗体与protein A/G琼脂糖珠偶连，8） 免疫沉淀反应后，在4 C以3,000 rpm速度离心5 min，将琼脂糖珠 离心至管底。将上清小心吸去，琼脂糖珠用lml裂解缓冲液洗34次。最后加 入15p 1-30p 1的1XSDS上样缓冲液，沸水煮10分钟，9） SDS-PAGE, Western blotting 或质谱仪分析。（3）注意的问题1）细胞裂解 采用温和的裂解条件，不能破坏细胞内存在的所有蛋白质蛋白质相互作用，多采用非离子变性剂（NP40或Triton X-100）。每种细胞的裂解条件 是不一样的，通过经验确定。一般如果相互作用很弱时可以考虑将盐浓度尽量降 低，同时可以考虑加入铰链剂。不能用高浓度的变性剂（0.2%SDS），细胞裂解液中要加各种酶抑制剂， 如商品化的 cocktail。2）使用明确的抗体，可以将几种抗体共同使用，抗体的用量参考抗体使用 说明书。3）使用对照抗体：单克隆抗体：正常小鼠的IgG或另一类单抗 兔多克隆抗体：正常兔 IgG4）在检测时如果发现对照组也有目的蛋白时，则表明有非特异的结合，这 是我们应当在 8）步多洗几次。5）所有操作均在 4C 进行。举例免疫共沉淀验证两种已知蛋白质的相互作用+X-HAY-GFP Y-GFPPY-GFGPFPIP: HA IgGa-GFP a-HAa-GFPIP: HA GFPiputa-HAa-HA a-GFP