生化实验思考题答案

生化实验讲义思考题参考答案实验一 淀粉的提取和水解1、实验材料的选择依据是什么？ 答：生化实验的材料选择原那么是含量高、来源丰富、制备工艺简单、本钱低。从科研工作 的角度选材，还应当注意具体的情况，如植物的季节性、地理位置和生长环境等，动物材料 要注意其年龄、性别、营养状况、遗传素质和生理状态等，微生物材料要注意菌种的代数和 培养基成分的差异等。2、材料的破碎方法有哪些？答：(1) 机械的方法： 包括研磨法、组织捣碎法；(2) 物理法：包括冻融法、超声波处理法、压榨法、冷然交替法等；(3) 化学与生物化学方法：包括溶胀法、酶解法、有机溶剂处理法等。实验二 总糖与复原糖的测定1、碱性铜试剂法测定复原糖是直接滴定还是间接滴定？两种滴定方法各有何优缺点？ 答: 我们采用的是碱性铜试剂法中的间接法测定复原糖的含量。间接法的优点是操作简便、 反响条件温和，缺点是在生成单质碘和转移反响产物的过程中容易引入误差；直接法的优点 是反响原理直观易懂，缺点是操作较复杂，条件剧烈，不易控制。实验五粗脂肪的定量测定一索氏提取法1本实验制备得到的是粗脂肪，假设要制备单一组分的脂类成分，可用什么方法进一步 处理？答：硅胶柱层析，高效液相色谱，气相色谱等。 2本实验样品制备时烘干为什么要防止过热?答：防止脂质被氧化。实验六 蛋白质等电点测定1、在别离蛋白质的时候，等电点有何实际应用价值？答: 在等电点时，蛋白质分子与分子间因碰撞而引起聚沉的倾向增加，所以处于等电点的蛋 白质最容易沉淀。在别离蛋白质的时候，可以根据待别离的蛋白质的等电点，有目的地调节溶液的pH使该蛋白质沉淀下来，从而与其他处于溶液状态的杂质蛋白质别离。实验七 氨基酸的别离鉴定纸层析法 1、如何用纸层析对氨基酸进展定性和定量的测定？答：将标准的氨基酸与待测的未知氨基酸在同一X层析纸上进展纸层析，显色后根据斑点的 Rf值，就可以对氨基酸进展初步的定性，因为同一个物质在同一条件下有一样的Rf值；将 点样的未知氨基酸溶液和标准氨基酸溶液的体积恒定，根据显色后的氨基酸斑点的面积与点 样的氨基酸质量成正比的原理，通过计算斑点的面积可以对氨基酸溶液进展定量测定。3、纸层析、柱层析、薄层层析、高效液相层析各有什么特点？答：支持介质层析原理层析方向上样量别离效率纸层析滤纸分配上行多或下行小低薄层层析玻璃板或塑料板分配、吸附上行较大较高柱层析玻璃柱分配、吸附、离子交换、分子筛、亲和层析等下行可小可大较高高效液相层析不锈钢柱分配、吸附可小可大高实验八蛋白质含量的测定 (1)简述紫外分光光度法测定蛋白质浓度的原理及优点。 答：原理：由于蛋白质分子中酪氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，因此蛋白质具有吸 收紫外线的性质，吸收顶峰在280 nm波长处。在此波长范围内，蛋白质溶液的光吸收值OD280与其含量呈正比关系，可用作定量测定。优点：迅速、简便、不消耗样品，低浓 度盐类不干扰测定。实验十影响酶活性的因素1本实验中如何通过淀粉液加碘后的颜色的变化来判断酶促反响快慢的？答：在唾液淀粉酶的作用下，淀粉水解，经过一系列被称为糊精的中间产物，最后生 成麦芽糖和葡萄糖。变化过程如下：淀粉紫色糊精红色糊精麦牙糖、葡萄糖淀粉、紫色糊精、红色糊精遇碘后分别呈蓝色、紫色与红色。麦芽糖和葡萄糖遇碘不 变色。因此反响后颜色如为蓝色说明酶活力低，淡黄色那么说明酶活力高。 2如何通过参加班氏试剂后生成沉淀多少来反映酶促反响快慢的？ 答：淀粉与糊精无复原性，或复原性很弱，对本尼迪克特试剂呈阴性反响。麦芽糖、葡萄糖 是复原糖，与本尼迪克特试剂共热后生成红棕色氧化亚铜的沉淀。因此，产生红棕色氧化亚 铜的沉淀越多说明酶活力越高。3通过本实验，结合理论课的学习，小结出哪些因素影响唾液淀粉酶活性？是如何影响 的？答：温度、pH、激活剂、抑制剂等。高于或低于最适温度或pH,酶活力都会降低；激活剂 和抑制剂不是绝对的，只是相对而言，随着浓度的变化而变化。实验十二碱性磷酸酶的别离提取及比活力的测定(1) 试说明用硫酸铵分级别离酶的方法及应注意的事件。答：用盐分级沉淀是一种应用非常广泛的方法。由于硫酸铵在水中溶解度很大20C，每升可溶 760 克,并且对许多酶没有很大的影响,因此它是最常用的盐。例如：某酶或蛋白 质发生盐析的范围为 35-65%饱和硫酸铵的浓度,因此可先选择30%饱和硫酸铵浓度,去 沉淀杂蛋白,然后选择70%饱和硫浓度酸铵,留沉淀含所要的酶。考前须知：在用硫酸铵沉淀酶蛋白时，要注意缓冲液的pH值和温度，盐的溶解度随温度不 同而有较大的变化,同时酶的溶解度亦随温度的改变而改变。在加硫酸铵时,需事先将硫酸 铵粉末研细。参加过程需缓慢并及时搅拌溶解。搅拌要缓慢,尽量防止泡沫的形成,以免酶 蛋白在溶液中外表变性。(2) 用正丁醇处理匀浆液可以有效地使碱性磷酸酶酶蛋白释放,使酶的产量大大提高,这是为什么？ 答：因为碱性磷酸酶酶是一种膜蛋白,正丁醇处理后可使结合在膜上的蛋白质更多地释放出 酶活力测定时，为什么必需先将酶液对缓冲液透析后才测定？答：去除盐离子的影响。实验十三凝胶过滤层析纯化碱性磷酸酶1.在本实验中要注意哪些重要环节？答：1）注意区分柱子的上下端。2）各接头不能漏气，连接用的小乳胶管不要有破损，否那么造成漏气、漏液。3）装柱要均匀，既不过松，也不过紧，最好在要求的操作压下装柱，流速不宜过快，防止 因此凝胶。4）始终保持柱内液面高于凝胶外表，否那么水分蒸发，凝胶变干。也要防止液体流干，使 凝胶混入大量气泡，影响液体在柱内的流动。5）核酸蛋白检测仪，记录仪，局部收集器要正确连接。6）要控制一定流速。7）收集得到的液体要进展酶活力的检测。实验十四底物浓度对酶活力的影响米氏常数的测定1.在测定酶催化反响的米氏常数K和最大反响速度V时，应如何选择底物浓度范围？mm答：底物浓度选择范围 0.2-5.0 Km为宜。底物浓度选取还应该注意其倒数能均匀分布。底物浓度太大底物浓度太小2. 试说明米氏常数K的物理意义和生物学意义。m答：Km是酶的一个极重要的动力学特征常数，Km物理含义：ES络合物消失速度常 数与形成速度常数之比；其数值相当于酶活性部位的一半被底物占据时所需的底物浓度。可根据Km估计底物浓度的水平。Km可作为同工酶的判断依据。(4) 鉴别最适底物。有助于在酶学研究中对底物浓度的选择。选用10Km浓度进展活力测定3. 为什么说米氏常数K是酶的一个特征常数而V那么不是？ mm答：某种酶的K在给定的体系中不随酶浓度改变而改变，也与酶的纯度无关，因此是酶的 m一个特征常数。但V随酶浓度改变而改变。m实验十七SDS-PAGE电泳简述SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳测定分子量的原理；答：1SDS能使蛋白质的氢键、疏水键翻开，并结合到蛋白质分子上，形成蛋白质-SDS 复合物。2SDS带有大量负电荷，当它与蛋白质结合时，消除或掩盖了不同种类蛋白质间原 有电荷的差异，使SDS与蛋白质的复合物都带上一样密度的负电荷。3SDS-蛋白质复合物在水溶液中的形状一样，都是近似于雪茄烟形的长椭圆棒。4不同的SDS-蛋白质复合物都带有一样密度的负电荷，并具有一样形状；因此在一定浓度的凝胶中，由于分子筛效应，那么电泳迁移率就成为蛋白质分子量的函数。 是否所有的蛋白质用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳方法测定得到的分子量都完全可靠？ 答：不是。如电荷异常或构象异常的蛋白质，带有较大辅基的蛋白质如某些糖蛋白以及一些 构造蛋白如胶原蛋白等。例如组蛋白F1,它本身带有大量正电荷，因此，尽管结合了正常比例的SDS,仍不能完全掩盖其原有正电荷的影响，它的分子量是21,000,但SDS-凝胶电泳测定的结果却是35,000。实验十八 维生素C的定量测定1简述本法测定VC的利与弊。答：碘量法测定VC相比其它方法传统的碘滴定法迅速、简捷，但易受到待测物颜色干扰而 不易判断滴定终点；只能测定待测溶液复原型的Vc含量，如果溶液中还含有其他复原型较 强的物质会影响测定结果；而且待测的复原型Vc易被空气氧化影响滴定结果。2为何以显蓝色在30s内不褪色为滴定终点？答：因为本方法是根据氧化复原反响测定的，待测的的溶液中可能含有其他比Vc复原性低 的物质，也能使碘分子被复原，使蓝色褪去，如果把这局部复原物质所消耗的碘液计算进去， 会照成误差，因此以显蓝色在30s内不褪色为滴定终点。