原代细胞培养：原代细胞分离培养鉴定以及检测等整体课题

Case :新生SD大鼠原代心房肌细胞分离与药物刺激培养冰检测相关蛋 白与基因实验设计一、细胞：分离大鼠原代心房肌细胞二、细胞培养分组：a）对照组：正常大鼠原代心房肌细胞72h培养b）高糖72h培养c）高糖+氧化应激抑制因子72h培养d）正常培养48h+氧化应激刺激因子再培养24he）高糖培养48h+氧化应激抑制因子再培养24hf）正常培养48h+ （氧化应激刺激因子+氧化应激抑制因子）共同培养24h三、蛋白检测：WB检测各组培养细胞中A蛋白与B蛋白的表达。四、荧光定量检测：荧光定量PCR方法检测各组培养细胞中A基因与B基因的表达。实验报告一、新生SD大鼠心房肌细胞的分离与培养：1、无菌条件下，取出1-3d龄SD大鼠心房组织，然后用PBS将此组织块清洗2次，最后将 组织剪成1mm3左右大小；2、往组织块中加入4mL酶消化液（0.1%胰酶和0.1% I型胶原酶），混悬10s，置37C条 件下消化10min，之后用滴管吹打制成单细胞悬液，自然沉淀并收集上清，用含10%FBS培养基 终止消化后4C放置；3、剩下的组织再加入34mL酶消化液，混悬10s，置37C消化10 min后，按上述方法收 集上清并终止消化后4C放置，重复此步骤2-3次，直至组织完全被消化；4、用200目不锈钢筛网过滤细胞消化液，1200r/min离心10min，弃去上清，沉淀细胞用 含有10% FBS DMEM/F12培养基混悬，接种于25cm2培养瓶，放置于37C，5%CO2培养箱中 您美一培养；5、差速贴壁1h后，吸出培养基，按实验需要接种于6孔板中继续培养；二、新生SD大鼠心房肌细胞的a -actin免疫荧光鉴定：1、待心房肌细胞生长至80%融合时，弃去培养基，用温育的PBS冲洗细胞2次，每次10min， 然后用4%多聚甲醛在室温条件下固定细胞15min；2、PBS冲洗细胞2次，每次10min，然后在4C条件下，用0.1 %Triton X-100透膜15min；3、PBS冲洗细胞2次，每次10min，然后在室温条件下，用4% BSA封闭细胞30min；4、按1: 100的比例稀释a -actin 一抗（Abbioscience公司），然后将其放在4C冰箱中 孵育细胞过夜；5、PBS冲洗细胞3次，每次10min，按1： 150的比例稀释抗a -actin的二抗（嘉美生物公 司），37 C条件下放置1h；6、用PBS冲洗3次，每次10min，最后在倒置荧光显微镜（Leica公司）下观察图像并拍照。200 X400 X三、Real-time PCR检测SD大鼠心房肌细胞CaMK-II6、A基因、B基因、FKBP12.6 mRNA表达 水平1、总RNA的提取：(1) 将细胞培养液吸出后，用PBS洗细胞2次，加入1 mL Trizol室温裂解细胞5min，用 移液器均匀吹下细胞并置于EP管中，上下轻柔颠倒10次，室温静置5min；(2) 加0.2 mL氯仿，颠倒混匀10次，室温静置5min，4C，12000rpm，离心20min；(3) 转上层水相于另一新EP管中，加入等体积异丙醇，颠倒混匀10次，-20C放置2h后， 4C，12000rpm，离心 15min；(4) 用移液器小心吸弃上清，加冰预冷的75%乙醇，4C，12000rpm，离心10min；(5) 弃上清，EP管倒扣，空气干燥10 min；(6) 将总RNA溶于适量DEPC处理水中，最后用分光光度计测量其浓度。2、第一链cDNA合成(Genecopoeia试剂盒)(1) 反应体系(20p L)：Total RNA 2p gOligo (dT)18 1p L10mM dNTPs 1p L5XRT Buffer 4p LRibonuclease Inhibitor 0.5p LTransScript RT 1p LddH2O to final volume 20p L(2) 轻轻混匀后，进行：a) 42C孵育 30min.b) 85C孵育 5min.c) -20 C，保存备用.3、Real-time PCR (Genecopoeia SYBR Green I 荧光染料试剂盒)(1) 引物序列：a、CaMK-IIO F： CTGGCACACCTGGGTATCTTCaMK-IIO R： ATCCCAGAAGGGTGGGTATCb、AGeneF：TAACCTACCAGGCCGTGGATAGeneR：GCTGCGATCTGGATAAGTTCAAc、BGeneF：GCAGTTGACTGAGGCGTCTTBGeneR：GGATTCGTGAGTGGCGATACd、FKBP12.6 F： CTGGAATTCATGGGCGTGGAGATCGAGFKBP12.6 R: GACTCGAGTCACTCTAAGTTGAGCAGCTCe、6 -actin F： GACGGTCAGGTCATCACTATCG6 -actin R： ACGGATGTCAACGTCACACTTC(2) 反应体系(25L)：F引物 0.5p LR引物 0.5p LSuperMix 12.5p LPassive Reference Dye 0.5p LcDNA 2p LddH2O 9p L(3) 程序设置如下(Eppendorf PCR仪)：95C3min95C20s55 C20s40循环72C20s95C15s60C15s60C-95C20min95C15s（4）Realplex软件导出数据并分析JJD UCnZSJJC 1 UH ngUJ邸1 D : m二口JX:_Lt1i 9c-c-cczC勺OtXDlrK-r-CCfrS-定CMc-carMMc-cuY5Y5.YiYSY3fr-TLlAl 莫法澹霎 恐志屯R2在本琵疆g i2RR&RiE12F5RMW 3US壬BHamGaG*.0 1 2 3 4 5 6 7 3 9 10 11 1211 1i 16 17 1S 19 23 21 22 23 24 25 36 2T 2S 29 30 31 32 33 3-1 35 36 37 33 3S 43ThressnoidTJolseEianKjBelhsewig 削们切日如.。爪 coiTewtm O-B基因0 1 i亨4 =与7 5字10 11 1*1+ 1 16 17 15悻以占乏U苏MT鑫溢 31 5浇24点 S 7能村40寄8矿=侣.淳sYSA 5i-6-_3 STzfi： WFG怛胡 R =： P-SP 1； .&J43. SY ER BTST SR ai .-s311； ST 3F=. Fr5-1；.6n-B. SYn=i 喧ICLgmiK.，sT&H STB日 A 2-urrq,多片弟,hUrHW苛寻 DS.Crai：5-fiM3.5Y3Fi. EiT金只 明 8 AaczrH-d D10.ET3RFKBP 12.6 基因四、WB检测新生SD大鼠心房肌细胞CaMK-II 6、A蛋白、B蛋白、FKBP12.6蛋白表达水平1、实验材料PBS、细胞裂解液、PMSF、BCA试剂盒(嘉美生物)、5X蛋白上样缓冲液、脱脂奶粉，CaMK- II6 一抗(Abbioscience)、B 蛋白一抗(Abbioscience)、FKBP12.6 一抗(Abbioscience)、 6 -actin 一抗(Abbioscience)和 B 蛋白一抗(Millipore)、山羊抗兔-HRP 二抗(abcam)、ECL Reagent (嘉美生物)、显影剂、定影剂。2、实验仪器细胞刮、1mL注射器、EP管、移液器、冷冻离心机、摇床、酶标仪、电泳器材、PVDF膜、 电转器材、X光片、压片盒。3、实验方法(1) 细胞裂解液配制：基础裂解液中加入0.2mmol/L PMSF蛋白酶抑制剂。(2) 蛋白样品制备： 弃去六孔板细胞中的培养基。 每孔细胞中加入2mL 4C预冷的PBS，平放轻轻摇动2min洗涤细胞，然后弃去PBS 洗液。重复以上操作。 每孔加入100口 L细胞裂解液在冰上对细胞进行裂解，然后用细胞刮将细胞刮下，最 后将裂解液移入干净的EP管中。 将EP管中细胞冰上裂解30min，在此期间用1mL注射器对裂解液进行反复抽吸20次。 裂解完后，于4C，12000rpm离心20min。然后将上清移入新的1.5mL EP管中，即 为所需蛋白样品。 每样本取3口 L蛋白提取液转入另外的EP管保存备定量用。向其余蛋白样品中加入 其1/4体积的蛋白上样缓冲液，沸水煮5min，最后将其一80C保存。(3) 蛋白浓度测定：根据嘉美生物BCA试剂盒说明书中步骤进行实验。具体步骤如下： 将0.5口 g/p L蛋白标准品按0、1、2、4、8、12、16ul加到96孔板中，然后将各 孔用细胞裂解液补足到20p L。 每样品加2p L到96孔板的样品孔中，然后将各孔补加18p L的细胞裂解液。 各孔加人200p LBCA工作液(BCA试剂A: BCA试剂B=50: 1)，37C条件下放置30min。 用酶标仪测定562nm波长处各孔的吸光度。最后根据标准曲线计算蛋白浓度。实验结 果见后面结果部分内容。(4) SDS-PAGE 电泳： 配胶：CaMK-IIO (1.5mm 10%分离胶，5%浓缩胶)、A蛋白、B蛋白(1.5mm 5%分离 胶，4%浓缩胶)、FKBP12.6 (1.5mm 15%分离胶，5%浓缩胶) 上样：取制备好的蛋白样品，使用前沸水煮5min，12000rpm离心2min。各样本之间 平衡后，每泳道上样45p L。 电泳：浓缩胶60V，分离胶100V，漠酚蓝移动至玻璃板底端，提示电泳结束，关闭电 源。(5) 转膜： 将PVDF膜放到甲醇中浸泡2min，然后把转膜海绵垫、滤纸、PVDF膜放置于电转液中 平衡30min。 将转膜夹打开，在代表负极的黑色面铺上一块湿润的海绵垫，再添加2层湿润的滤纸， 将电泳好的SDS-PAGE分离胶小心地铺在滤纸上方，表面再覆盖大小合适的PVDF膜；然后再覆盖 两层湿润滤纸，再垫上湿润的海绵垫，最后将转膜夹的红色面与黑色面闭合好，将其放入转膜槽 中相应的位置。 转膜 CaMK-IIO (100V，60min) ； A 蛋白、B 蛋白(100V，180min) ； FKBP12.6 (80V， 30min)，转膜全过程在冰上进行。 丽春红染色：转膜完成后，将膜从转膜夹中取出，立即投入丽春红染液中染色，大约 染色3min后将膜从丽春红染液中取出，用DDH2O轻轻冲洗膜，注意观察膜上的红色条带，当条 带足够清晰后停止水洗，根据蛋白Marker位置适当剪膜，留出目的蛋白所在的范围。最后用DDH2O 彻底洗膜，尽可能洗去残留的丽春红染料。(6) 封闭：室温条件下，5%脱脂奶粉+TBST在摇床上封闭1h。(7) 一抗杂交：CaMK-IIO (1:500)、A 蛋白(1:200)、B 蛋白(1:50)、FKBP12.6 (1:300)、6 -actin (1:1000)，4C孵育过夜。(8) 洗膜：TBST洗膜3次，每次10min。(9) 二抗杂交：山羊抗兔-HRP二抗(1:2500)，室温孵育1h。(10) 洗膜：TBST洗膜3次，每次10min。(11) 显影：首先，用滤纸吸去膜上的液体，将膜平放于保鲜膜上，将新鲜配置好的ECL Reagent 滴加到膜面上，反应3min后用滤纸在膜的边缘尽量吸去多余的ECL Reagent，然后根据条带的 亮度将膜放到压片夹中曝光适当的时间，最后，显影、定影、冲洗胶片及对胶片进行扫描分析。BCA试剂盒蛋白定量实验结果：标准品 OD 值分别为：0.488、0.519、0.559、0.603、0.668、0.759、0.884LG 组、NG 组、HG 组、HG+U 组 OD 值分别为：0.646、0.677、0.671、0.698ONOO 组、DC-ONOO 组、ONOO+U 组 OD 值分别为：0.816、0.703、0.79、0.612WB实验结果：LG 盼： HG-.吟 ULG WG HG59 KU=26Q :KJLGNGH免B蛋白；24E KD1.2 EDFKBF 1Z?.642 KU铉 畛、 HG :盼如P actitl嘉美生物是一家主要从事Annexin V,信号转导抗体，重组人和动物蛋白，磷酸化抗体，各种动物ELISA试剂 盒,生物实验服务等研发与销售的高科技生物公司。相关文章 芯片类检测：Luminex PLEXMAP BIOPLEX液相芯片检测实验服务 细胞生物学实验：流式分选外包服务 免疫学实验：流式CBA多因子检测外包实验 分子生物学外包服务：个性化治疗分子检测外包服务 热点实验服务：国家自然科学基金等基金的申请外包服务 热点实验服务：大陆核心期刊三包服务（实验、撰写、发表） 原代细胞培养服务：原代细胞分离培养鉴定以及检测等整体课题服务 原代细胞培养服务：原代肝细胞定制服务