β-内酰胺酶在肝细胞肝癌中的表达及临床意义

B -内酰胺酶在肝细胞肝癌中的表达及临床意义背景肝细胞肝癌(Hepatocellular Carcinoma,HCC)简称为肝癌，是消化系统 最为常见的原发性恶性肿瘤。相关调查显示,每年约有100万新发的肝细胞肝癌 的病例被检测出来,其中,超过三分之二的新病例分布在西太平洋地区1。肝细胞肝癌的死亡率居全球第二位,最新研究数据显示,在全世界由恶性肿 瘤造成的死亡事件中，肝细胞肝癌所占的比例最高2。HCC具有起病隐匿、高度 恶性和快速进展的特征，且HCC患者的早期诊断仍是一个尚未被攻克的巨大挑战。大多数患者在肿瘤已发展为晚期时才得到明确诊断，而HCC的常用治疗方案 如外科切除、肝移植、射频消融等手术治疗的禁忌症较多，因此，通过上述手术疗 法来达到根治肝癌的目标的几率很低3,4。有研究显示HCC治疗后的1年总体 生存率较为良好，为66.1%，而3年、5年总体生存率则分别降至39.7%和32.5%; 在早期HCC患者中分别为93.5%、70.1%和59.1%5。但由于缺乏灵敏的早期诊断方法,HCC的病死率依然很高。鉴于目前HCC治 疗方法尚未被攻克的局限性，确定HCC发生的分子机制并开发新的早期诊断和预 后预测策略至关重要。越来越多的证据表明，代谢失调尤其是异常脂质代谢在包括HCC在内的肿瘤 进展中发挥着巨大作用6-9。B -内酰胺酶(beta-lactamase,LACTB)主要位于哺 乳动物有核细胞的线粒体内，在人体的不同组织中普遍存在，特别是在骨骼、心脏 肌肉和肝脏。作为哺乳动物活性位点丝氨酸蛋白，LACTB与细菌青霉素结合蛋白在进化上 相关。LACTB可作为线粒体内膜组织和能量稳态的调节因子参与脂质代谢的调节, 继而抑制肿瘤进展，同时作为细胞代谢过程的新型蛋白酶同源物起作用10。此外，研究表明LACTB在一些恶性肿瘤如乳腺癌11、胶质瘤12、胃癌13 和结直肠癌14,15中的表达低于癌旁组织，过表达LACTB可以抑制肿瘤细胞的 增殖。以上研究表明LACTB可作为一种新型的表观遗传沉默肿瘤抑制因子，在肿 瘤的进展中发挥着重要作用。然而,LACTB在HCC中的表达情况和功能作用在很大程度上仍未被探索。目 的1.探究LACTB在肝细胞肝癌中表达水平的具体情况:分析TCGA数据库中 LACTB mRNA在肝癌及癌旁组织中的转录水平是否有差异，以及LACTB mRNA转录 水平与肝癌患者TNM分期、病理学分级和整体生存率(Overall survival rate,OSR)的相关性;探究LACTB在郑州大学队列的肝癌及癌旁组织中的表达 水平是否有差异，以及LACTB表达水平与肝癌患者TNM分期、病理学分级和整体 生存率的相关性;2.探究过表达LACTB对肝癌细胞的表型的影响:体外过表达 LACTB对肝癌细胞的增殖、迁移和侵袭等生物学行为的影响;体内实验验证过 表达LACTB对裸鼠成瘤能力的影响。方法：1.下载TCGA(the cancer genome at las)数据库中肝癌患者的临床信 息以及LACTB mRNA转录水平相关数据进行筛选和整合，分别分析LACTB mRNA在 肝癌及配对的癌旁组织中的转录水平，及LACTB mRNA转录水平与肝癌患者TNM 分期、病理学分级和总生存率的相关性。 2.选取341例肝细胞肝癌患者的组织标 本，这些患者于2011年至2015年就诊于郑州大学第一附属医院，且经过病理诊断 确诊为肝癌。利用这些标本构建组织微阵列(Tissue microarray,TMA)备用。3.采取免疫 组织化学(Immunohistochemical,IHC)染色法检测临床组织样本中LACTB蛋白质 表达水平，并分析肝癌组织中LACTB表达水平与患者的临床病理特征的相关性及 其对肝癌预后的影响。4.利用慢病毒转染技术过表达LACTB,并经蛋白印迹方法确认后，采取CCK-8 实验、EdU染色实验和克隆形成实验检测肝癌细胞的增殖能力，采取细胞划痕实 验和Transwell实验检测肝癌细胞的迁移和侵袭能力。5.采用表达LACTB的肝癌 细胞注射到裸鼠皮下,利用活体成像仪记录皮下肿瘤的生长速度,6周后处死小 鼠取出肿瘤,并利用IHC方法检测LACTB及Ki-67的表达情况。6.采用GraphPad Prism软件(7.0版)和SPSS软件(版本23.0)分析统计数据。 采用卡方检验来检测LACTB表达水平与肝癌患者临床病理学特征的相关性，采用 t检验用于比较组间差异;采用Kaplan-Meier生存分析探究不同的LACTB表达水 平对肝癌预后的影响。结果：1.TCGA分析结果显示,LACTB mRNA在肝癌组织中的表达水平比正常组 织明显降低；LACTB的表达水平在具有高病理学分级的患者中显著低表达,而在 不同TNM分期的患者中LACTB的表达水平则未表现出明显的差异。 2.Kaplan-Meier分析显示LACTB低表达的肝癌患者总体存活率(Overall survival,OS)和无复发生存率(Relapse-free survival,RFS)显著低于 LACTB 高 表达的患者。GSEA分析结果显示，与肝癌患者生存负相关的基因显著富集于LACTB低表达 组，相反，与肝癌存活正相关的基因显著富集于LACTB高表达组。3.免疫组化染色 结果显示肝癌组织中LACTB蛋白表达水平显著低于配对的癌旁组织;LACTB表达 在TNM分期I-II和III-IV之间存在显著差异，并且在高TNM分级的组织中表达 更低。4.LACTB低表达的肝癌患者总体存活率(OS)显著低于LACTB高表达的患者。 由单、多因素分析可知,低表达LACTB和高级别TNM分期是肝癌患者独立预后危 险因素。5.体外细胞实验的结果显示,过表达 LACTB 可以显著抑制肝癌细胞在体外的 增殖、迁移及侵袭能力。6.体内实验结果显示,过表达 LACTB 对于肝癌细胞在体 内的成瘤能力具有显著的抑制作用。结论:低表达的LACTB与肝癌患者的临床预后密切相关。过表达LACTB在体 外实验中可抑制肝癌细胞增殖、迁移、侵袭及体内肿瘤生成。LACTB 有望成为肝癌的早期诊断及判断患者预后的生物标志物,也为肝癌的 靶向治疗提示了新的思路。