高效液相色谱法(3)课件

高效液相色谱法(3)课件高效液相色谱法高效液相色谱法High Performance Liquid Chromatography （HPLC）高效液相色谱法(3)课件 前言前言:HPLC是是70年代以后发展最年代以后发展最快的一个分析化学分支，现快的一个分析化学分支，现已成为已成为生化、医学、药物、生化、医学、药物、化学化工、食品卫生、环保化学化工、食品卫生、环保检测检测等领域最常用的分离分等领域最常用的分离分析手段。析手段。高效液相色谱法(3)课件我国：我国：开始仅为少数研究实验室拥有，开始仅为少数研究实验室拥有，现很多的生产、研究、质检部门。现很多的生产、研究、质检部门。广泛应用于广泛应用于质量控制质量控制、分析化验分析化验、制备分制备分离。离。例：例：讲课目的：讲课目的：入门入门 教材问题：教材问题：学习要求：学习要求：高效液相色谱法(3)课件课时安排：课时安排：第一章：高效液相色谱的基本原理第一章：高效液相色谱的基本原理 6学时学时第二章：高效液相色谱的仪器装置第二章：高效液相色谱的仪器装置 2学时学时第三章：液固、液液、键合相色谱第三章：液固、液液、键合相色谱 4学时学时第四章：离子交换色谱和离子对色谱第四章：离子交换色谱和离子对色谱 3学时学时 第五章：凝胶渗透色谱第五章：凝胶渗透色谱 1学时学时第六章：实验技术和辅助实验技术第六章：实验技术和辅助实验技术 2学时学时机动机动 2学时学时第第3、5、7周实验周实验高效液相色谱法(3)课件参考书籍：参考书籍：1.色谱理论基础（卢佩章、戴朝政编）色谱理论基础（卢佩章、戴朝政编）2.高效液相色谱法（邹汉法、张玉奎、高效液相色谱法（邹汉法、张玉奎、卢佩章编著）卢佩章编著）3.高效液相色谱方法及应用高效液相色谱方法及应用（色谱技术丛书、化学工业出版社、（色谱技术丛书、化学工业出版社、于于世林编著世林编著)高效液相色谱法(3)课件本课程基本要求：本课程基本要求：1.掌握色谱法的分类及有关术语；掌握色谱法的分类及有关术语；2.了解柱效的影响因素；了解柱效的影响因素；3.掌握分离度的影响因素；掌握分离度的影响因素；4.了解定性、定量分析方法；了解定性、定量分析方法；5.掌握液相色谱仪的基本结构及功能；掌握液相色谱仪的基本结构及功能；6.掌握常用的液相色谱法基本概念及分离掌握常用的液相色谱法基本概念及分离对象对象7.掌握液相色谱的基本操作技能；掌握液相色谱的基本操作技能；高效液相色谱法(3)课件第一章第一章 高效液相色谱法基本原理高效液相色谱法基本原理1-1 概述概述 一一.发展历史发展历史:100多年前俄国植物学家多年前俄国植物学家Tswett分离分离 植物色素植物色素时采用的实验方法时采用的实验方法:Tswett用希腊语用希腊语chroma(色色)和和graphos(谱谱)描述他的实验方法描述他的实验方法 即即:Chromatography(色谱法色谱法)高效液相色谱法(3)课件色谱法的发展色谱法的发展 1906年正式命名年正式命名 20世纪世纪30年代开始广泛研究和应用年代开始广泛研究和应用 (柱色谱柱色谱,薄层色谱薄层色谱气相色谱气相色谱)高效液相色谱法的广泛应用始于高效液相色谱法的广泛应用始于20世纪世纪70年代年代高效液相色谱法(3)课件n现代液相色谱分析方法。现代液相色谱分析方法。n经典液相色谱法为基础，经典液相色谱法为基础，n引入气相色谱法的理论和实验技术，引入气相色谱法的理论和实验技术，n高压输送流动相，高压输送流动相，n高效固定相及高灵敏度检测器高效固定相及高灵敏度检测器.高效液相色谱法(3)课件二、色谱法概述二、色谱法概述 混合物最有效的分离、分析方法。色谱法是一种分离技术。混合物分离过程：试样中各组分在 色谱分离柱中的两相间不断进行着的 分配。一相固定不动，称为固定相。另一相是携带试样混合物流过固定 相的液体，称为流动相。高效液相色谱法(3)课件高效液相色谱法的高效液相色谱法的特性特性:高压、高效、高速、高灵敏。高压、高效、高速、高灵敏。适用：适用：高沸点高沸点、热不稳定热不稳定样品样品 高效液相色谱法(3)课件液相色谱仪液相色谱仪高效液相色谱法(3)课件高效液相色谱法(3)课件三、色谱法原理三、色谱法原理混合物中各组份在不同的两相中混合物中各组份在不同的两相中溶解溶解,吸吸附附等化学作用性能的差异等化学作用性能的差异,当两相相对运当两相相对运动时动时,使各组分在两相中反复多次受到上使各组分在两相中反复多次受到上述各作用力而达到相互分离述各作用力而达到相互分离两相中一相是固定的两相中一相是固定的,叫作固定相叫作固定相(Stationary Phase),一相是流动的一相是流动的,称为流动相称为流动相(Mobile Phase),(洗脱剂洗脱剂,溶剂溶剂)高效液相色谱法(3)课件分离原理分离原理:分离是一个分离是一个物理物理过程。过程。固定相固定相(Stationary Phase)流动相流动相(Mobile Phase)进样进样(Injection)洗脱洗脱(Elution)相互作用相互作用(Interaction)高效液相色谱法(3)课件 当混合物进入色谱柱后，就在固定相、流动相当混合物进入色谱柱后，就在固定相、流动相之间之间不断不断地进行分配平衡。地进行分配平衡。不同的化合物，分子不同的化合物，分子结构不同，理化性质不同，所以在两相中存在的结构不同，理化性质不同，所以在两相中存在的浓度也各不相同。浓度也各不相同。固定相中固定相中存在量多存在量多的化合物，的化合物，冲洗出柱子的时间就冲洗出柱子的时间就长长，反之则，反之则短短。这与分配系。这与分配系数数K K有关：有关：K K值小，先流出柱子，值小，先流出柱子，K K值大的，保留作用强，后值大的，保留作用强，后流出柱子。流出柱子。mS ccK组分在流动相中的浓度组分在固定相中的浓度高效液相色谱法(3)课件四、高效液相色谱法的特点四、高效液相色谱法的特点高压高压 以液体作为流动相，液体流经色谱柱时，以液体作为流动相，液体流经色谱柱时，受到阻力较大受到阻力较大 必须对流动相施加高压。必须对流动相施加高压。一般可达到一般可达到150300kgcm2，甚至可达甚至可达700kgcm2以上。以上。高效液相色谱法(3)课件高速高速 所需的分析时间较经典液体色谱少得所需的分析时间较经典液体色谱少得多（交换速度快），流量可达多（交换速度快），流量可达l10mLmin 高效高效 气相色谱的分离效能很高，高效液气相色谱的分离效能很高，高效液相色谱的柱效则更高（化学键合相），相色谱的柱效则更高（化学键合相），一般约可达一般约可达 6000理论塔板米理论塔板米高效液相色谱法(3)课件高灵敏度高灵敏度 紫外检测器的最紫外检测器的最小检小检测量可达测量可达(10-9 g)；荧光检测器的灵敏度可达荧光检测器的灵敏度可达10-11g。所需试样很少；微升数量级所需试样很少；微升数量级高选择性高选择性 可分离不同类型化合物和异构体，也可分可分离不同类型化合物和异构体，也可分析在性质上极为相似的化合物析在性质上极为相似的化合物(同位素、同分异构体、空间异构体、手性化同位素、同分异构体、空间异构体、手性化合物）合物）高效液相色谱法(3)课件五、五、HPLCHPLC与与GCGC区别区别 1分析对象的区别分析对象的区别 GC：适于能气化、热稳定性好、沸点低的样适于能气化、热稳定性好、沸点低的样 品，品，占有机物的占有机物的20%HPLC：适于溶解后能制成溶液的样品适于溶解后能制成溶液的样品.对分子量大、难气化、热稳定性差对分子量大、难气化、热稳定性差 样品均可检测样品均可检测。占有机物的占有机物的80%高效液相色谱法(3)课件2 2流动相的区别流动相的区别GCGC：流动相为惰性，组分与流动相无亲合作用流动相为惰性，组分与流动相无亲合作用 力，只与固定相有相互作用。力，只与固定相有相互作用。HPLCHPLC：流动相为液体，流动相与组分间有亲合作用流动相为液体，流动相与组分间有亲合作用 力，能提高柱的选择性、改善分离度力，能提高柱的选择性、改善分离度.对分离起主要作用。对分离起主要作用。3 3操作条件差别操作条件差别 4.4.分析样品区别分析样品区别GCGC：加温操作加温操作 GCGC：破坏样品，不能回收破坏样品，不能回收HPLCHPLC：室温；高压室温；高压 HPLCHPLC：不破坏样品，能回收不破坏样品，能回收说明：说明：气相、液相地位同样重要气相、液相地位同样重要 两种互补不足的色谱方法两种互补不足的色谱方法 灵敏度：灵敏度：气相气相液相液相 应用范围：应用范围：液相气相液相气相高效液相色谱法(3)课件六、色谱法的分类六、色谱法的分类吸附色谱吸附色谱(Absorption Chromatography)(Absorption Chromatography)组分对固定相表面吸附力的不同而分离组分对固定相表面吸附力的不同而分离分配色谱分配色谱(Partition Chromatography)(Partition Chromatography)组分在固定相和流动相中的溶解度不同而分离组分在固定相和流动相中的溶解度不同而分离离子交换色谱离子交换色谱(Ion Exchange Chromatography)(Ion Exchange Chromatography)组份离子交换亲和力的差异而分离组份离子交换亲和力的差异而分离体积排除色谱体积排除色谱(Size Exclusion Chromatography)(Size Exclusion Chromatography)组分分子量大小不同组分分子量大小不同,对固定相的渗透力不同对固定相的渗透力不同而分离而分离高效液相色谱法(3)课件基本概念基本概念一、色谱图一、色谱图 检测器将流动相中各组分浓度变化转检测器将流动相中各组分浓度变化转变为相应的电信号。变为相应的电信号。记录仪所记录下的浓度对分离时间的记录仪所记录下的浓度对分离时间的函数，称为函数，称为色谱图。色谱图。高效液相色谱法(3)课件高效液相色谱法(3)课件色谱过程特点：色谱过程特点：浓度对分离时间呈浓度对分离时间呈高斯曲线型高斯曲线型色谱条件一定时，各组分都有一色谱条件一定时，各组分都有一特定特定时时间在图谱中出现，称为组分的保留时间。间在图谱中出现，称为组分的保留时间。柱效一定时，组分保留值柱效一定时，组分保留值越小越小，峰越，峰越 窄；窄；保留值保留值越大越大，峰越，峰越宽宽。相邻峰的保留时间相邻峰的保留时间相差越大相差越大，越易，越易分离分离。高效液相色谱法(3)课件常用术语：常用术语：1.基线基线:仅有仅有纯流动相纯流动相进入检测器时的流进入检测器时的流 出曲出曲 线。线。2.色谱峰色谱峰:响应信号大小随时间变化所形成的峰响应信号大小随时间变化所形成的峰 形曲线。形曲线。(正态分布正态分布).峰高与峰面积：峰高与峰面积：峰高：峰高：色谱峰顶点与峰底之间的垂直距离色谱峰顶点与峰底之间的垂直距离 用用h表示。表示。高效液相色谱法(3)课件峰面积：峰面积：峰与峰底之间的面积峰与峰底之间的面积，用，用A表示。表示。二、色谱保留二、色谱保留 1.保留时间（保留时间（tR）从进样开始到柱后出现样品的浓度从进样开始到柱后出现样品的浓度极大值所需的时间，用极大值所需的时间，用tR表示。表示。高效液相色谱法(3)课件2.2.分配系数分配系数K K 组分在固定相和流动相间发生的组分在固定相和流动相间发生的吸附、脱附，或溶吸附、脱附，或溶解、挥发解、挥发的过程叫做的过程叫做分配过程分配过程。在一定温度下，组分在。在一定温度下，组分在两相间分配达到平衡时的两相间分配达到平衡时的浓度比浓度比（单位：（单位：g/mLg/mL），称为），称为分配系数分配系数，用，用K K 表示表示:MS ccK组分在流动相中的浓度组分在固定相中的浓度分配系数是色谱分离的依据。分配系数是色谱分离的依据。高效液相色谱法(3)课件分配系数分配系数K K 的讨论的讨论 一定温度下，组分分配系数一定温度下，组分分配系数K K越大，出峰越慢；越大，出峰越慢；每个组份在各种每个组份在各种固定相固定相上的分配系数上的分配系数K K不同；不同；选择适宜的选择适宜的固定相固定相可改善分离效果；可改善分离效果；各组分有不同各组分有不同K K 值是分离的基础（差移速度）值是分离的基础（差移速度）某组分的某组分的K K=0=0时，即不被固定相保留，最先流时，即不被固定相保留，最先流 出。出。组分在流动相中的浓度组分在固定相中的浓度K高效液相色谱法(3)课件3.3.容量因子容量因子k k(capacity factor)(capacity factor)一定温度下，组分在两相间分配达到平衡时的一定温度下，组分在两相间分配达到平衡时的质量比。质量比。MMS Smmmmk k 组组分分在在流流动动相相中中的的质质量量组组分分在在固固定定相相中中的的质质量量 1.1.与与kk都是与都是与组分组分及及固定相固定相的热力学性质有的热力学性质有关关 的常数的常数,随随分离柱温度、柱压分离柱温度、柱压的改变而变化的改变而变化2.2.与与kk都是衡量色谱柱对组分保留能力的参都是衡量色谱柱对组分保留能力的参数数 ，数值越大，该组分的保留时间越长。，数值越大，该组分的保留时间越长。3.3.容量因子可以由实验测得。容量因子可以由实验测得。高效液相色谱法(3)课件4.4.容量因子与保留时间的关系容量因子与保留时间的关系 推导推导:ux：组分在分离柱内的迁移速度；组分在分离柱内的迁移速度；u：流动相在分离柱内的迁移速度；流动相在分离柱内的迁移速度；,MSMSMk11mm11mmmwummmummmummmumsmsmssmmsmx高效液相色谱法(3)课件组分和流动相通过长度组分和流动相通过长度L的分离柱，需要时间分别为的分离柱，需要时间分别为tR和和t0，则，则 tR=to(1+k)0oRtttkk太小太小-没有充分利用填料的分离能力没有充分利用填料的分离能力k太大太大-分析时间太长分析时间太长 k范围：范围：k 1/0（0溶剂强度溶剂强度-使组分迁移快慢的能力）使组分迁移快慢的能力）P310 表表3-10u uL Lt t;u uL Lt t0 0 x xR R高效液相色谱法(3)课件作业：作业：思考题思考题:1、2、3、4、5、6、8、9高效液相色谱法(3)课件5.选择性系数选择性系数 可用来衡量两物质的分离程度，用表示。1R2R1212ttkkKK高效液相色谱法(3)课件色谱理论需要解决的问题？色谱理论需要解决的问题？色谱分离过程的热力学和动力学问题。色谱分离过程的热力学和动力学问题。组分保留时间为何不同？色谱峰为何变宽？组分保留时间为何不同？色谱峰为何变宽？组分保留时间：组分保留时间：色谱过程的热力学因素控制；色谱过程的热力学因素控制；（组分和固定相的结构和性质）（组分和固定相的结构和性质）色谱峰变宽：色谱峰变宽：色谱过程的动力学因素控制；色谱过程的动力学因素控制；（两相中的运动阻力，扩散）（两相中的运动阻力，扩散）两种色谱理论：两种色谱理论：塔板理论和速率理论。塔板理论和速率理论。高效液相色谱法(3)课件1-3 色谱柱的分离效率色谱柱的分离效率一、塔板理论一、塔板理论 塔板理论认为塔板理论认为:一根柱子可以分为一根柱子可以分为n段，段，每段内组分在两相间迅速达到平衡，每段内组分在两相间迅速达到平衡，把每一段称为一块理论塔板。把每一段称为一块理论塔板。设柱长为设柱长为L，理论塔板高度为，理论塔板高度为H，则，则 H=L/为理论塔板数。为理论塔板数。高效液相色谱法(3)课件 理论塔板数一理论塔板数一N色谱峰对称色谱峰对称：说明：说明：a.在给定的操作条件下，在给定的操作条件下，N几乎相同几乎相同b.N为常量时，为常量时，tw 随随 tR 成正比例变化成正比例变化c.与柱长有关与柱长有关:比较不同长度色谱柱的柱效时，比较不同长度色谱柱的柱效时，应当比较它们在相同柱长下的应当比较它们在相同柱长下的N值。值。例例d.是一种理想状态是一种理想状态2WR)tt16(N高效液相色谱法(3)课件 有拖尾峰时有拖尾峰时:可用半峰宽来表示可用半峰宽来表示N：N554(tR/W1/2)2 W1/2 -半峰宽半峰宽例：例：测得测得tR=105mm、W1/2=4mm，求得，求得N=3789，若此柱长为，若此柱长为250mm,折成每米的理折成每米的理论塔板数约为论塔板数约为15200.高效液相色谱法(3)课件理论塔板高度理论塔板高度HNLH2Rw)tt(16LH2WR)tt16(N物理意义：物理意义：组分在两相间达到一次平衡对应组分在两相间达到一次平衡对应 的柱长的柱长 H愈小愈小组分在两相间平衡分配次数越多组分在两相间平衡分配次数越多 柱效柱效（不能说明分离一定实现）（不能说明分离一定实现）高效液相色谱法(3)课件说明：说明：大，固定相分离潜能大。大，固定相分离潜能大。（分离与否，还取决于其他色谱条件）（分离与否，还取决于其他色谱条件）一定色谱条件下，对一定色谱条件下，对k有差异的组分，有差异的组分，则柱效愈高，分离效果愈好。则柱效愈高，分离效果愈好。高效液相色谱法(3)课件塔板理论的特点和不足：塔板理论的特点和不足：(1)(1)当当L L一定时，一定时，N N 越大越大(H H 越小越小)，被测组，被测组 分在柱内被分配的次数越多，柱效越分在柱内被分配的次数越多，柱效越 高，所得色谱峰越窄。高，所得色谱峰越窄。(2)(2)柱效不能表示被分离组分的实际分离柱效不能表示被分离组分的实际分离 效果：如两组分的分配系数效果：如两组分的分配系数K K 相同，相同，无论该色谱柱的柱效多大，都无法无论该色谱柱的柱效多大，都无法 分离。分离。高效液相色谱法(3)课件(3)(3)塔板理论塔板理论无法解释无法解释同一色谱柱在同一色谱柱在 不同的流动相流速下柱效不同的不同的流动相流速下柱效不同的 实验结果，也实验结果，也无法指出无法指出影响柱效影响柱效 的因素及提高柱效的途径。的因素及提高柱效的途径。高效液相色谱法(3)课件二二.峰扩展和速率方程式峰扩展和速率方程式1.1.峰扩展峰扩展-由于柱内柱外各种因素引起由于柱内柱外各种因素引起的色谱峰变宽或变形，从而造成色谱柱的色谱峰变宽或变形，从而造成色谱柱效的降低效的降低峰扩展程度：取决于组分在柱内峰扩展程度：取决于组分在柱内平衡分平衡分 配次数配次数 例：例：引起峰扩展因素：引起峰扩展因素：柱内、柱外柱内、柱外高效液相色谱法(3)课件柱外因素柱外因素检测器流动池体积（尽量小）检测器流动池体积（尽量小）柱出口到检测器的连接管（尽量短）柱出口到检测器的连接管（尽量短）进样器死体积进样器死体积高效液相色谱法(3)课件2.速率方程式速率方程式（范（范弟姆特方程式）弟姆特方程式）H=A+B/u+Cu H：理论塔板高度，理论塔板高度，u：流动相流速流动相流速(cm/s)。减小减小A、B、C 三项可提高柱效。三项可提高柱效。A，B，C 三项各与哪些因素有关？三项各与哪些因素有关？高效液相色谱法(3)课件A A 涡流扩散项涡流扩散项 A A=2=2ddp p d dp p：固定相的平均颗粒直：固定相的平均颗粒直径径 ：固定相的填充不均匀因子：固定相的填充不均匀因子 固定相颗粒越小固定相颗粒越小d dpp，填充得越均匀，填充得越均匀，A A，H H，柱效柱效。表现在涡流扩散所引起的色谱峰变宽现象。表现在涡流扩散所引起的色谱峰变宽现象减轻，色谱峰较窄。减轻，色谱峰较窄。高效液相色谱法(3)课件B B/u u 分子扩散项分子扩散项 B B=2 =2 DD D D：试样组分分子的扩散系数（：试样组分分子的扩散系数（cmcm2 2ss-1-1）(1)(1)存在着浓度差，产生纵向扩散存在着浓度差，产生纵向扩散;(2)(2)扩散导致色谱峰变宽，扩散导致色谱峰变宽，H H()，分离变差，分离变差;(3)(3)B B/u u与流速有关：流速与流速有关：流速 滞留时间滞留时间 扩散扩散 (0.5ml/min)0.5ml/min)(4)(4)扩散系数扩散系数D D，B B 值值。液相中，分子扩散可忽略液相中，分子扩散可忽略高效液相色谱法(3)课件C C u u 传质项传质项 传质传质溶质分子在两相间浓度不同，由浓度高的相不断迁溶质分子在两相间浓度不同，由浓度高的相不断迁 移至浓度低的相，直到浓度达到平衡。移至浓度低的相，直到浓度达到平衡。根据传质形式分：固定相传质和移动相传质根据传质形式分：固定相传质和移动相传质 C=（Cs+Cm）固定相传质原因：进出固定相固定相传质原因：进出固定相速度速度不同（固相，液相）不同（固相，液相）减小措施：减小措施：使用薄的固定相层，使用薄的固定相层，小颗粒填料小颗粒填料移动相传质：迁移滞留移动相传质：迁移滞留减小措施减小措施 填装均匀紧密填装均匀紧密 使用小颗粒填料和表面多孔性填料使用小颗粒填料和表面多孔性填料高效液相色谱法(3)课件高效液相色谱法(3)课件3.3.速率理论的要点速率理论的要点:(1)(1)柱内的峰扩展与涡流扩散、分子扩散、柱内的峰扩展与涡流扩散、分子扩散、传质阻力有关。固液两相间的分配平衡传质阻力有关。固液两相间的分配平衡不能瞬间达到是造成色谱峰扩展、柱效不能瞬间达到是造成色谱峰扩展、柱效下降的主要原因。下降的主要原因。(2)(2)通过选择适当的固定相粒度、液膜厚通过选择适当的固定相粒度、液膜厚度及流动相流速可提高柱效。度及流动相流速可提高柱效。高效液相色谱法(3)课件(3)(3)为色谱分离和操作条件选择提供了为色谱分离和操作条件选择提供了理论指导。阐明了流速和填料对柱效及理论指导。阐明了流速和填料对柱效及分离的影响。分离的影响。(4)(4)各种因素相互制约：流速增大，分各种因素相互制约：流速增大，分子扩散项的影响减小，使柱效提高，但子扩散项的影响减小，使柱效提高，但同时传质阻力项的影响增大，又使柱效同时传质阻力项的影响增大，又使柱效下降；下降；选择最佳条件，才能使柱效达到最高。选择最佳条件，才能使柱效达到最高。高效液相色谱法(3)课件4.4.获得高柱效的几种方法：获得高柱效的几种方法：选用细的颗粒填料选用细的颗粒填料流动相流速低流动相流速低流动相粘度小流动相粘度小升高温度升高温度溶质扩散系数与其结构有关溶质扩散系数与其结构有关 大分子，扩散系数小大分子，扩散系数小 小分子，扩散系数大小分子，扩散系数大高效液相色谱法(3)课件5.5.影响分离的因素与提高柱效的途径影响分离的因素与提高柱效的途径 液体的扩散系数仅为气体的万分之一，在高效液液体的扩散系数仅为气体的万分之一，在高效液相色谱中相色谱中,速率方程中的分子扩散项速率方程中的分子扩散项B/uB/u较小，可忽略较小，可忽略不计，即不计，即 H=A+C uH=A+C u 降低传质阻力是提高柱降低传质阻力是提高柱效主要途径。效主要途径。气相和液相区别气相和液相区别高效液相色谱法(3)课件分离度分离度 色谱分离目的：色谱分离目的：合理的时间内将样品中组分成功合理的时间内将样品中组分成功 分离分离分离度：表示分离状况的一种度量分离度：表示分离状况的一种度量分离度影响因素：分离度影响因素：保留值之差保留值之差色谱过程的热力学因素；色谱过程的热力学因素；峰的宽度峰的宽度色谱过程的动力学因素。色谱过程的动力学因素。高效液相色谱法(3)课件讨论：讨论：色谱分离中的四种色谱分离中的四种情况：情况：柱效较高，柱效较高，K K(分配系数分配系数)较大，完全分离。较大，完全分离。K K 不是很大，柱效较高，峰较窄，基本分离。不是很大，柱效较高，峰较窄，基本分离。柱效较低，柱效较低，K K 较大，但分离的不好。较大，但分离的不好。K K 小，柱效低，分离效果更差。小，柱效低，分离效果更差。高效液相色谱法(3)课件高效液相色谱法(3)课件一分离度的表达式：一分离度的表达式：R=0.8：两峰的分离程度可达：两峰的分离程度可达89%；R=1：分离程度：分离程度98%(达到定性定量分析的最低要求达到定性定量分析的最低要求)R=1.5：达：达99.7%（相邻两峰（相邻两峰达到基线分离达到基线分离）。）。699.1)(2)(2)1(2/1)2(2/11R2R121R2RYYttWWttRs高效液相色谱法(3)课件对浓度不同组分而言：对浓度不同组分而言：两个组分的分离度会随浓度比的增大而两个组分的分离度会随浓度比的增大而 减小减小 例：例：对多组分而言：对多组分而言：整个色谱分离的分离度取决于整个色谱分离的分离度取决于Rs最小最小值的两个峰。值的两个峰。高效液相色谱法(3)课件二分离度影响因素二分离度影响因素峰的宽度峰的宽度（峰宽越小，（峰宽越小，Rs越大）越大）峰的宽窄主要反映了色谱分离的峰的宽窄主要反映了色谱分离的动力学动力学特性特性两峰的保留时间之差两峰的保留时间之差（tR越大，越大，Rs越大）越大）反映了色谱分离的反映了色谱分离的热力学热力学特性特性分离度基本分离度基本关系式关系式：1 1k k k k 1 1N N4 41 1R Rs s121R2R)(2WWttRs高效液相色谱法(3)课件四控制分离度方法四控制分离度方法改变改变k调节溶剂强度可以改变调节溶剂强度可以改变k增大增大-使用较弱溶剂使用较弱溶剂降低降低-使用较强溶剂使用较强溶剂正相色谱正相色谱-固定相极性大于移动相固定相极性大于移动相 （溶剂极性大（溶剂极性大溶剂强度大溶剂强度大洗脱能力强洗脱能力强小）小）反相色谱反相色谱-固定相极性小于移动相固定相极性小于移动相（溶剂极性大（溶剂极性大溶剂强度小溶剂强度小洗脱能力弱洗脱能力弱大）大）例：例：P307311高效液相色谱法(3)课件更换色谱柱（改变更换色谱柱（改变N）措施：措施：a.选择长柱子选择长柱子(N=L/H)b.填料颗粒尽量小填料颗粒尽量小c.低流速低流速(溶质传质阻力小，峰扩展小溶质传质阻力小，峰扩展小)d.低的溶剂粘度低的溶剂粘度(提高柱效提高柱效)e.提高柱温提高柱温2WR)tt16(N 高效液相色谱法(3)课件改变选择性系数改变选择性系数1R2R1212ttkkKK（=1=1，不能实现分离不能实现分离)下列途径改善：下列途径改善：a.流动相流动相(梯度洗脱梯度洗脱)P279 （适用于极性范围宽的样品）（适用于极性范围宽的样品）b.固定相固定相(换柱，改变填料）换柱，改变填料）c.温度温度（改变热力学参数）（改变热力学参数）高效液相色谱法(3)课件五五.分离度控制的一般原则分离度控制的一般原则:开始开始k值很小，若要增大值很小，若要增大Rs，则首先应将，则首先应将k调整至调整至1 k 10范围，这样，不用改变其范围，这样，不用改变其他条件，就可使他条件，就可使Rs增大。增大。开始开始k已在已在1 k 10范围，但范围，但Rs不大，不大，则必须增大则必须增大N来改善来改善Rs。k，N的改变都不能增大的改变都不能增大Rs时，再设法改变时，再设法改变高效液相色谱法(3)课件作业：思考题：7，1017 高效液相色谱法(3)课件第二章第二章 仪器装置仪器装置 四大部件：四大部件：高压输液泵高压输液泵进样器进样器高效分离柱高效分离柱检测器检测器 高效液相色谱法(3)课件21 高压输液泵高压输液泵作用：作用：向色谱柱输送一个向色谱柱输送一个连续、恒定连续、恒定的移动相。的移动相。一、对泵系统的要求一、对泵系统的要求1.使用方便（易调节流量、过压保护等）使用方便（易调节流量、过压保护等）2.更换洗脱液容易、死体积小更换洗脱液容易、死体积小3.有最大工作压力有最大工作压力(20MPa，130MPa)4.一定流量范围（一定流量范围（直径小，流量小；速度快，流直径小，流量小；速度快，流量大。量大。）（）（0.110ml/min)5.流量稳定性好流量稳定性好(流量噪声、流量波动、流量漂流量噪声、流量波动、流量漂 移移）6.流量精度高流量精度高高效液相色谱法(3)课件机械往复式柱塞泵的机械往复式柱塞泵的工作原理：工作原理：高效液相色谱法(3)课件特点：特点：能连续供给恒定体积的移动相，不受整个能连续供给恒定体积的移动相，不受整个色谱系统中其余部分稍有变化的影响。色谱系统中其余部分稍有变化的影响。死体积较小，约死体积较小，约0.1ml，更换溶剂方便，适，更换溶剂方便，适用于用于梯度洗脱。梯度洗脱。缺点：缺点：输出有输出有脉冲波动脉冲波动二个因素：二个因素：脱气不完全脱气不完全 泵的周期性吸液泵的周期性吸液影响检测灵敏度。（对紫外检测器影响不大）影响检测灵敏度。（对紫外检测器影响不大）高效液相色谱法(3)课件梯度淋洗装置梯度淋洗装置外梯度外梯度:利用两台高压输液利用两台高压输液泵，将两种不同极性的泵，将两种不同极性的溶剂按一定的比例送入溶剂按一定的比例送入梯度混合室，混合后进梯度混合室，混合后进入色谱柱。入色谱柱。内梯度内梯度:一台高压泵一台高压泵,通过通过比例调节阀比例调节阀,将两种或将两种或多种不同极性的溶剂多种不同极性的溶剂按一定的比例抽入高按一定的比例抽入高压泵中混合。压泵中混合。高效液相色谱法(3)课件泵系统发展趋势泵系统发展趋势高效：填料颗粒高效：填料颗粒分离效率分离效率 柱压降柱压降泵的工作压力泵的工作压力分析时间短：更快流速分析时间短：更快流速柱压降柱压降 (超快速分析）超快速分析）减少洗脱液用量减少洗脱液用量(4.6mm1mm)液相色谱的多元洗脱系统液相色谱的多元洗脱系统P277280高效液相色谱法(3)课件22 色谱色谱柱柱组成：组成：精密管径的不锈钢管、填料、柱接头精密管径的不锈钢管、填料、柱接头要求：要求：柱管内壁非常光滑柱管内壁非常光滑 柱接头设计要保证系统中引入最小柱接头设计要保证系统中引入最小 死体积（柱前、柱后）死体积（柱前、柱后）能密封高压液体能密封高压液体 两端加过滤片两端加过滤片高效液相色谱法(3)课件 柱体为直形不锈钢管，内径柱体为直形不锈钢管，内径16 mm，柱长，柱长540 cm。减小填料粒度和柱径以提高柱效。减小填料粒度和柱径以提高柱效。高效液相色谱法(3)课件柱效的影响因素柱效的影响因素填料的颗粒度及其均匀性填料的颗粒度及其均匀性柱长、填装的方法与技巧柱长、填装的方法与技巧 常用：常用：内径内径25mm（4.6mm)柱效一定时，柱长与颗粒度成正比柱效一定时，柱长与颗粒度成正比例如：颗粒度例如：颗粒度510um、柱长、柱长1530cm 颗粒度颗粒度35um、柱长柱长7.515cmP282283高效液相色谱法(3)课件23 进样装置进样装置 六通进样阀六通进样阀 P280281 结构如图：结构如图：高效液相色谱法(3)课件2-4 检测系统检测系统功能：功能：连续地将色谱柱中流出的组分随时间连续地将色谱柱中流出的组分随时间 变化的情况，转变成大小不同的电信变化的情况，转变成大小不同的电信 号输入到记录仪中，得到色谱图。号输入到记录仪中，得到色谱图。按检测方式不同，分为：按检测方式不同，分为：总体性质检测器（通用型）总体性质检测器（通用型）示差折射检测器示差折射检测器溶质性质检测器（选择型）溶质性质检测器（选择型）紫外检测器、荧光检测器、电导检测器紫外检测器、荧光检测器、电导检测器高效液相色谱法(3)课件检测器的性能指标检测器的性能指标一个理想检测器，必须具备下列条件：一个理想检测器，必须具备下列条件：灵敏度高灵敏度高不受温度及流动相流速变化的影响不受温度及流动相流速变化的影响响应随组分量的变化而线性地变化响应随组分量的变化而线性地变化稳定性好，操作方便稳定性好，操作方便高效液相色谱法(3)课件衡量指标：衡量指标：灵敏度灵敏度 S=R/Q噪音在没有样品情况下，检测器输出的最大噪音在没有样品情况下，检测器输出的最大 振幅振幅（温度、流量、泵）（温度、流量、泵）漂移检测器在一段时间内，基线随时间的增漂移检测器在一段时间内，基线随时间的增 加而产生的偏离加而产生的偏离（电压、流动相）（电压、流动相）最小检测限样品产生两倍于噪音信号时的浓最小检测限样品产生两倍于噪音信号时的浓度度（检测下限）（检测下限）线性范围检测信号呈线性变化时，最大和最线性范围检测信号呈线性变化时，最大和最 小进样量之比小进样量之比高效液相色谱法(3)课件检测器检测器 紫外检测器（光电二极管阵列检测器）光电二极管阵列检测器）示差折光检测器 荧光检测器 电导检测器 高效液相色谱法(3)课件 a.紫外检测器紫外检测器 应用最广，对大部分应用最广，对大部分有机有机化合物化合物有响应。有响应。特点：特点：灵敏度高；灵敏度高；线性范围宽；线性范围宽；流通池可做得很小流通池可做得很小(1mm 10mm，容积，容积 8L)；对流动相的流速和温度变化不敏感；对流动相的流速和温度变化不敏感；波长可选，易于操作波长可选，易于操作(波长范围，常用波长）波长范围，常用波长）200400nm 254nm、280nm 可用于梯度洗脱。可用于梯度洗脱。高效液相色谱法(3)课件b.光电二极管阵列检测器光电二极管阵列检测器 紫外检测器的重要进展；光电二极管阵列检测器：1024个二极管阵列，各检测特定波长，计算机快速处理，三维立体谱图。高效液相色谱法(3)课件光电二极管阵列检测器光电二极管阵列检测器高效液相色谱法(3)课件三维：光谱三维：光谱-色谱图色谱图高效液相色谱法(3)课件检测原理检测原理比尔定律：比尔定律：A=c L紫外检测器优点：紫外检测器优点：灵敏度高（灵敏度高（1010g/ml)对梯度洗脱是一种理想检测器对梯度洗脱是一种理想检测器局限性：局限性：不能检测对紫外光没有吸收的样品不能检测对紫外光没有吸收的样品不能使用对紫外光有吸收的溶剂不能使用对紫外光有吸收的溶剂P289293高效液相色谱法(3)课件第三章第三章 液固色谱和键合相色谱液固色谱和键合相色谱 31 液固吸附色谱液固吸附色谱一、原理一、原理:固定相是极性吸附剂，固定相是极性吸附剂，不同组份官能团具有不不同组份官能团具有不同极性，因而对固定相同极性，因而对固定相的吸附能力不同。的吸附能力不同。极性越大，吸附能力极性越大，吸附能力越强；极性越低，吸附越强；极性越低，吸附能力越弱而导致分离。能力越弱而导致分离。Flow流动相流动相活性吸附点活性吸附点固定相固定相高效液相色谱法(3)课件存在竞争吸附：存在竞争吸附：吸附解吸平衡吸附解吸平衡 溶质、流动相分子之间溶质、流动相分子之间 溶质中不同官能团之间溶质中不同官能团之间 竞争的结果，导致了分离。竞争的结果，导致了分离。溶质在柱内受到两种力作用：溶质在柱内受到两种力作用：固定相的吸附力固定相的吸附力 流动相的溶解力流动相的溶解力 当吸附力溶解力当吸附力溶解力 k大大 吸附力溶解力吸附力溶解力 k小小高效液相色谱法(3)课件二分离对象：二分离对象：官能团有差别的不同类型化合物官能团有差别的不同类型化合物 （烷基类吸附弱，不能分离）（烷基类吸附弱，不能分离）几何异构体几何异构体 (固定相表面是刚性结构固定相表面是刚性结构 溶质分子官能团与吸附中心的相互作溶质分子官能团与吸附中心的相互作用随分子的几何形状而改变）用随分子的几何形状而改变）高效液相色谱法(3)课件三填料的类型及其选择三填料的类型及其选择按形状分：按形状分：a.球形球形 b.无定形无定形按多孔程度分：按多孔程度分：a.多孔型多孔型 b.薄壳型薄壳型按极性分：按极性分：a.极性（硅胶、极性（硅胶、Al2O3、MgO、分子筛）、分子筛）b.非极性（活性碳）非极性（活性碳）高效液相色谱法(3)课件四、硅胶的活性控制及标准化四、硅胶的活性控制及标准化硅胶的特点：硅胶的特点：活性控制意义：活性控制意义：标准化方法：标准化方法：市售未处理硅胶市售未处理硅胶加热加热46小时，活小时，活化去水，再加进定量水分，使吸附剂含化去水，再加进定量水分，使吸附剂含水量保持恒定。水量保持恒定。（100m2表面积含水表面积含水0.020.03g为佳）为佳）高效液相色谱法(3)课件吸附强度分类吸附强度分类根据化合物结构类型，可将它们根据化合物结构类型，可将它们在硅胶上在硅胶上 的吸附强度排序：的吸附强度排序：P315归纳：归纳：官能团不同官能团不同极性不同极性不同吸附强度不同吸附强度不同几何异构体几何异构体空间位置不同空间位置不同吸附强度吸附强度不同不同P314-316 P331-333P314-316 P331-333高效液相色谱法(3)课件分子空间效应。分子空间效应。n 与官能团相邻的大烷基可能降低保留与官能团相邻的大烷基可能降低保留能力；（位阻效应）能力；（位阻效应）n 顺式化合物的保留能力可能比反式化顺式化合物的保留能力可能比反式化合物强；合物强；n 对位化合物的保留能力可能比邻位化对位化合物的保留能力可能比邻位化合物强。合物强。高效液相色谱法(3)课件五样品分子结构对保留的影响五样品分子结构对保留的影响 对吸附色谱来说对吸附色谱来说,主要取决于主要取决于样品分子所含的样品分子所含的官能团的类型及其数目官能团的类型及其数目。常见官能团的吸附强度：常见官能团的吸附强度：不吸附：不吸附：烷烃烷烃 弱吸附：弱吸附：烯烃、硫醇、硫醚、单环或双环芳烯烃、硫醇、硫醚、单环或双环芳 烃、卤代芳烃烃、卤代芳烃中等吸附：中等吸附：多环芳烃、醚、腈、硝基物、大多多环芳烃、醚、腈、硝基物、大多 数羰基化合物数羰基化合物 强吸附：强吸附：醇、酚、胺、酰胺、亚枫、酸和多醇、酚、胺、酰胺、亚枫、酸和多 官能团化合物官能团化合物 高效液相色谱法(3)课件六、六、液相色谱的流动相液相色谱的流动相1.1.流动相实用要求流动相实用要求（1 1）溶剂的纯度和化学特性必须满足）溶剂的纯度和化学特性必须满足 色谱过程的稳定性和重复性要求。色谱过程的稳定性和重复性要求。（2 2）避免使用与固定相发生不可逆反应溶剂。）避免使用与固定相发生不可逆反应溶剂。（使用（使用AIAI2 2O O3 3-避免酸、使用硅胶避免碱）避免酸、使用硅胶避免碱）（3 3）溶剂应不干扰使用检测器的正常工作，与检测器相匹）溶剂应不干扰使用检测器的正常工作，与检测器相匹 配。配。使用的溶剂应当易于除去，不干扰对分离组分的回收。使用的溶剂应当易于除去，不干扰对分离组分的回收。高效液相色谱法(3)课件2.2.流动相分类流动相分类 按流动相组成分按流动相组成分：单组分和多组分；单组分和多组分；按极性分：按极性分：极性、弱极性、非极性；极性、弱极性、非极性；按使用方式分：按使用方式分：一般淋洗和梯度淋洗。一般淋洗和梯度淋洗。常用溶剂：常用溶剂：正相正相:己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、正戊烷正戊烷 正庚烷正庚烷 反相反相:甲醇甲醇、乙腈、水溶液。乙腈、水溶液。高效液相色谱法(3)课件LSC LSC 流动相的选择流动相的选择 在吸附色谱中在吸附色谱中,对溶质保留值和分离选择性起对溶质保留值和分离选择性起主导作用的是溶质与固定相的作用主导作用的是溶质与固定相的作用,流动相主要流动相主要是调节溶质的保留值在适当范围内。是调节溶质的保留值在适当范围内。溶剂强度溶剂强度洗脱能力洗脱能力 k k 液固吸附色谱的流动相液固吸附色谱的流动相值要适当，值要适当，常用正己烷、正庚烷常用正己烷、正庚烷,添加少量添加少量CHCH2 2ClCl2 2、CHClCHCl3 3、CHCH3 3CNCN和和CHCH3 3OHOH。(混合后的溶剂强度在两种纯溶剂之间）混合后的溶剂强度在两种纯溶剂之间）o o 高效液相色谱法(3)课件液固色谱的应用特点：液固色谱的应用特点：对具有不同极性取代基的化合物表现出较高的对具有不同极性取代基的化合物表现出较高的选选 择性，但对同系物的分离能力较差择性，但对同系物的分离能力较差对强极性或离子型样品，因有时会发生不可逆对强极性或离子型样品，因有时会发生不可逆 吸附，液固色谱常不能获得满意的分离结果。吸附，液固色谱常不能获得满意的分离结果。吸附剂的含水量对吸附剂活性、样品容量和保吸附剂的含水量对吸附剂活性、样品容量和保 留值有较大影响留值有较大影响 液固吸附色谱主要应用于液固吸附色谱主要应用于:结构异构体、几何异构体的分离。结构异构体、几何异构体的分离。高效液相色谱法(3)课件NH2NH2NH2NH2NH2NH2OHOHH2NNH2思考：思考：在液固色谱中，以硅胶为固定相，对以下四在液固色谱中，以硅胶为固定相，对以下四 组分进行分离，流出色谱柱的顺序可能是：组分进行分离，流出色谱柱的顺序可能是：a.a.邻苯二胺邻苯二胺 b b对苯二胺对苯二胺 c c间苯二胺间苯二胺 a.a.苯酚苯酚 b.b.对羟基苯胺对羟基苯胺 c.c.苯胺苯胺 d.d.苯苯12高效液相色谱法(3)课件作业作业思考题：思考题：19、20、2225、2729、3144高效液相色谱法(3)课件3-2 反相键合相色谱RR=H,CH3,(CH2)nCH3 n=1,2,3.键合相色谱是目前键合相色谱是目前HPLCHPLC中最常见的分离模式中最常见的分离模式,约约80%80%的的HPLCHPLC是采用反相键合相色谱。是采用反相键合相色谱。烷基苯同系物分离分析烷基苯同系物分离分析 多环芳烃分离分析多环芳烃分离分析高效液相色谱法(3)课件反相键合相色谱反相键合相色谱定义定义固定相通过某种化学反应将有机分固定相通过某种化学反应将有机分 子以共价键结合在子以共价键结合在色谱担体色谱担体的表面，的表面，这种色谱类型称之。这种色谱类型称之。制备制备硅胶基质硅胶基质化学键合固定相注意点：化学键合固定相注意点：键合反应前，将硅胶表面硅氧烷全部水键合反应前，将硅胶表面硅氧烷全部水 解为硅烷醇。解为硅烷醇。除去硅胶表面吸附水，使表面完全呈自除去硅胶表面吸附水，使表面完全呈自 由硅醇基。由硅醇基。高效液相色谱法(3)课件 形成化学键合固定相形成化学键合固定相 具备条件：具备条件：所用基质材料所用基质材料 应有某种化学应有某种化学反应活性反应活性有能与基质表面发生有能与基质表面发生 化学反应的化学反应的官能团官能团高效液相色谱法(3)课件化学键合固定相化学键合固定相 (P303)a.硅氧碳键型：硅氧碳键型：SiOC b.硅氧硅碳键型：硅氧硅碳键型：SiOSi C 稳定，耐水，耐光，耐有机溶剂，应用最广稳定，耐水，耐光，耐有机溶剂，应用最广 c.硅碳键型：硅碳键型：SiC d.硅氮键型：硅氮键型：SiN高效液相色谱法(3)课件化学键合固定相的特点：化学键合固定相的特点：（1 1）传质快传质快:表面无深凹陷。表面无深凹陷。（2 2）寿命长寿命长:化学键合，耐流动相冲击；化学键合，耐流动相冲击；稳定。稳定。（3 3）选择性好选择性好:可键合不同官能团，提高选可键合不同官能团，提高选 择性择性（4 4）有利于梯度洗脱。有利于梯度洗脱。由于产生弱极性固定相，因而扩展了反相色由于产生弱极性固定相，因而扩展了反相色谱分离技术的应用。谱分离技术的应用。反相色谱反相色谱正相色谱正相色谱高效液相色谱法(3)课件存在着存在着双重分离机制双重分离机制：由键合基团的由键合基团的覆盖率覆盖率决定决定n高覆盖率：分配为主；高覆盖率：分配为主；n低覆盖率：吸附为主。低覆盖率：吸附为主。常用反相键合固定相：常用反相键合固定相：C18、C8 P300P302高效液相色谱法(3)课件反相色谱保留机理反相色谱保留机理两种观点两种观点:疏溶剂理论疏溶剂理论（溶质与极性溶剂疏远）（溶质与极性溶剂疏远）双保留机理双保留机理 （残留羟基）（残留羟基）高效液相色谱法(3)课件影响溶质保留的因素影响溶质保留的因素 流动相流动相 组分的保留随流动相极性的减少而减少组分的保留随流动相极性的减少而减少,ln k ln k H H2 2O%,O%,有机溶剂有机溶剂%增大增大,极性下降极性下降,k,k值随值随之下降。之下降。思考：思考：在在ODSODS柱上，用柱上，用70%70%甲醇甲醇/水或水或60%60%甲醇甲醇/水洗脱苯系物，哪一种流动相使苯系物的保水洗脱苯系物，哪一种流动相使苯系物的保留值大，为什么？留值大，为什么？高效液相色谱法(3)课件 键合固定相：键合固定相：a.a.烷基覆盖量增加，烷基覆盖量增加，kk值随之增大。值随之增大。b.b.烷基链长增加烷基链长增加,k,k值随之增大。值随之增大。思考：思考：同样是同样是70%70%甲醇流动相，苯在甲醇流动相，苯在C C1818比比C C8 8柱柱上的保留值大，为什么？上的保留值大，为什么？高效液相色谱法(3)课件 溶质溶质 非离子化合物非离子化合物：极性大：极性大,k,k值小值小 非极性化合物：非极性化合物：分子表面积大分子表面积大,k,k值大值大 同系物：链长增大同系物：链长增大,k,k值增大值增大 苯系物：苯系物：环数增大环数增大,k,k值增大值增大;若化合物的非极性部分相同若化合物的非极性部分相同,极性官能团增极性官能团增 加加,则则kk值下降值下降 几何异构体几何异构体：能形成内氢键的异构体的化合：能形成内氢键的异构体的化合 物物 kk值大。值大。高效液相色谱法(3)课件碳链增大碳链增大 疏水性疏水性增大增大 保留越大保留越大流动相极性增大，流动相极性增大，保留增大保留增大高效液相色谱法(3)课件反相色谱中流动相选择反相色谱中流动相选择水有机改善剂水有机改善剂常用：常用：甲醇、乙腈、甲醇、乙腈、四氢呋喃、二氧六环四氢呋喃、二氧六环极性：有机改善剂水极性：有机改善剂水洗脱能力：有机改善剂水洗脱能力：有机改善剂水极性顺序：极性顺序：甲醇乙腈二氧六环四氢呋喃甲醇乙腈二氧六环四氢呋喃洗脱能力：洗脱能力：水甲醇乙腈二氧六环四氢水甲醇乙腈二氧六环四氢 呋喃呋喃高效液相色谱法(3)课件反相键合相色谱的优点：反相键合相色谱的优点：流动相可选用水溶性流动相可选用水溶性 样品的溶解度范围提高样品的溶解度范围提高 流动相可变性大流动相可变性大 柱重现性好柱重现性好固定相表面化学能低固定相表面化学能低 平衡容易平衡容易 梯度洗脱梯度洗脱固定相选择多固定相选择多固定相耐溶剂冲洗固定相耐溶剂冲洗 热稳定性好热稳定性好高效液相色谱法(3)课件缺点：缺点：流动相流动相PH范围要控制范围要控制（PH28）pH太低：太低：Si-C键易断裂键易断裂 pH太高：硅胶基质易溶解太高：硅胶基质易溶解游离的硅羟残基影响分离游离的硅羟残基影响分离（封尾）（封尾）P328-331 高效液相色谱法(3)课件RR=H,CH3,(CH2)nCH3 n=1,2,3.思考思考 烷基苯同系物分离分析烷基苯同系物分离分析 多环芳烃分离分析多环芳烃分离分析出峰顺序？出峰顺序？如何选择色谱条件？如何选择色谱条件？如何优化分离？如何优化分离？高效液相色谱法(3)课件第四章、离子交换色谱，离子对色第四章、离子交换色谱，离子对色谱谱离子交换色谱：离子交换色谱：适用于离子型物质的适用于离子型物质的分离和分析分离和分析4-1 4-1 离子交换色谱离子交换色谱一一.原理：原理：用离子交换剂用离子交换剂作固定相，以具有一定作固定相，以具有一定pHpH值的缓冲溶液作流动值的缓冲溶液作流动相，样品中各离子依据相，样品中各离子依据它们与离子交换剂的交它们与离子交换剂的交换能力大小来进行分离换能力大小来进行分离的色谱方法。的色谱方法。高效液相色谱法(3)课件原理：原理：流动相流动相(溶质离子溶质离子)+离子交换剂离子交换剂(反离子反离子)平衡时，平衡常数为平衡时，平衡常数为ABRBARB/AK离子交换部分取代高效液相色谱法(3)课件控制控制k可以改变流动相的离子强度可以改变流动相的离子强度注：注：只有当溶质呈离子状态时，才能在离子只有当溶质呈离子状态时，才能在离子 交换柱上有保留交换柱上有保留(流动相流动相p和溶质都是很重要的参数和溶质都是很重要的参数)ABRBARB/AK/,AARKBBRkAB高效液相色谱法(3)课件二、离子交换剂二、离子交换剂 阳离子交换剂阳离子交换剂带负电荷官能团带负电荷官能团 -SO3-(磺酸型）、磺酸型）、-COO-(羧酸型）羧酸型）阴离子交换剂阴离子交换剂带正电荷官能团带正电荷官能团 NH3（氨基型）、（氨基型）、NR3（季胺型）（季胺型）常见：常见：硅胶为基