免疫检验自动化仪器分析

第二十章 免疫检验自动化仪器分析,免疫检验自动化 （automation of immunoassays) 是将免疫学反应检测过程中的取样、加试剂、混合、温育、固相载体分离、信号检测、数据处理、打印报告和检测后的仪器清洗等步骤由计算机控制，自动化进行。,第一节 自动化免疫浊度分析系统,免疫浊度分析的基本原理是：抗原、抗体在特定的电解质溶液中反应，形成小分子免疫复合物（19S），使反应液出现浊度。在抗体稍微过量且固定的情况下，形成的免疫复合物量随抗原量的增加而增加，反应液的浊度亦随之增大，即待测抗原量与反应溶液的浊度呈正相关。,一定波长的入射光线通过抗原抗体反应后的溶液时，被其中的免疫复合物微粒吸收、反射和折射而减弱，在一定范围内，吸光度与免疫复合物量呈正相关，而形成的免疫复合物量与参与反应的抗原和抗体的量呈函数关系。与已知浓度的抗原标准品比较，可确定标本中抗原含量。,一、免疫透射比浊法,（一）原理：,1.将待检标本和抗原参考品作适当稀释。,（二）仪器工作过程,2.将待测标本和标准抗原溶液（5个浓度抗原标准品）与适当过量的抗血清混合，在一定条件下，抗原抗体反应完成后，在340nm处测定各管吸光度。,3.按log-logit转换或y=ax3+bx2+cx+d方程进行曲线拟合，制备剂量-反应曲线，由计算机处理，计算出抗原浓度。,（三）方法评价,优点: 灵敏度高，稳定性好，操作简便，结果准确,不足: 抗体用量较大； 溶液中存在的抗原抗体复合物分子应足够大 透射比浊测定在抗原抗体反应的第二阶段，检 测需在抗原抗体反应达到平衡后进行，耗时较长。,用抗体致敏的大小适中、均匀一致的胶乳颗粒（一般为0.2 m），在遇到相应抗原时，胶乳颗粒上的抗体与抗原特异结合，引起胶乳颗粒凝聚 ，使透射光和散射光即出现显著变化。如图所示：a为单个胶乳颗粒不阻碍光线透过，b为抗原抗体结合形成的凝聚胶乳大颗粒使透射光减弱或散射光增强。,二、免疫胶乳比浊法,（一）原理：,（二）方法评价,本法敏感度大大高于普通比浊法，可达ng/L水平，操作简便，易自动化；血清中的类风湿因子(RF)可与IgG Fc段结合，使IgG致敏胶乳颗粒出现非特异性凝集，用F(ab)2片段代替IgG既可消除此干扰，又可克服IgG致敏胶乳的自凝现象；免疫胶乳轻度自凝或抗体活性降低会严重影响结果。,粒子对光线的散射作用是溶液中的微粒子受到光线照射后，微粒子对光线产生反射和折射而形成散射光。悬浮微粒对光散射形成的散射光强度与微粒的大小、数量、入射光的波长和强度、测量角度等因素密切相关，其公式如下：,三、免疫散射比浊法,(一) 原理,式I 中为与入射光成角处散射光强度；和I0为入射光的波长和强度；dn/dc为校正因子，反映了溶液折射指数和颗粒浓度的变化；M为颗粒分子量；c为浓度；N为阿佛加德指数；为颗粒到检测器的距离；为散射光与入射光的夹角（散射夹角）。,II042（dn/dc) 2 Mc(1+cos) N24,定时散射比浊法是在保证抗体过量的情况下，加入待测抗原，此时反应立即开始，在反应的第一阶段，溶液中产生的散射光信号波动较大，所获取的信号计算出的结果会产生一定的误差。定时散射比浊法是避开抗原抗体反应的不稳定阶段，即散射光信号在开始反应7.5s2min内的第一次读数，专门在抗原抗体反应的最佳时段进行读数，将检测误差降到最低。,(二)定时散射比浊法（fixed time nephelometry）,定时散射比浊法测定原理示意图,1. 仪器测定技术要点,(1) 抗原抗体预反应阶段 (2) 反应阶段(3) 信号检测,2. 抗原过量检测,(1) 抗体适当过量 (2) 对抗原过量进行阈值限定,BN ProSpec全自动特定蛋白分析仪,速率散射比浊法是抗原抗体结合反应的动力学测定法。所谓速率是指抗原抗体反应在单位时间内形成免疫复合物的量（不是免疫复合物累积的量），连续测定各时间复合物形成的速率与其产生的散射光信号联系在一起，形成动态的速率散射比浊法，每项检测仅12min即可完成。,(三)速率散射比浊法（rate nephelometry）,仪器测定技术要点,开启机器，进行定标 反应阶段 抗原过量检测,抗原抗体复合物形成的速率,抗原抗体反应速率的动态变化,IMMAGE全自动特定蛋白分析仪,(三)方法评价,散射比浊法是目前临床应用较多的一种方法，本法自动化程度高，具有快速、灵敏、准确、精密等优点。采用抗原过量检测方法，保证了结果的准确性。但仪器和试剂价格比较贵, 对抗体的质量要求很高。,1.抗原抗体比例 2.抗体的质量 3.增浊剂的使用,（一）免疫比浊分析的影响因素,四、免疫比浊分析的影响因素和临床应用,4.伪浊度 5.入射光光源和波长 6.结果报告中的计量单位 7.标准曲线制备与质量控制,（二）临床应用,免疫比浊分析法主要用于检测免疫球蛋白IgG、IgA、IgM、链、链、免疫球蛋白亚类；补体C3、C4；血浆蛋白如前白蛋白(PAB)、白蛋白(ALB)、1-抗胰蛋白酶(1-AT)、2-微球蛋白(2-MG)、转铁蛋白(TRF)、铜蓝蛋白(CER)、结合珠蛋白(HP)、，C-反应蛋白(CRP)、载脂蛋白ApoAI、ApoB、脂蛋白(a)、类风湿因子(RF)、尿微量蛋白系列和某些治疗性药物浓度等。,第二节自动化学发光免疫分析系统,自动化发光免疫分析仪主要由样本盘、试剂盘(盒)、温育反应系统、固相载体分离清洗系统、信号检测系统和计算机数据处理、控制系统组成。,吖啶酯标记的化学发光免疫分析仪是一种用发光剂直接标记抗体或抗原的一类免疫分析法。该仪器利用化学发光技术和磁性微粒子分离技术，以吖啶酯为化学发光剂，以细小的顺磁性微粒为固相载体。其测定原理与双抗体夹心法、双抗原夹心法和竞争结合法等相同。,一、吖啶酯标记化学发光免疫分析仪,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,顺磁性微粒示意图,磁微粒技术,磁微粒在电磁场中分离,磁微粒标记抗体,发光,Y,Y,Y,磁微粒,被测抗原,+,抗体,+,带丫啶酯标记物抗体,冲洗后,双抗体夹心法,直接化学发光的机理,（1）加入酸性H2O2（pH10）,仪器测定技术要点,抗原抗体结合 洗涤、分离 加入氧化剂发光 信号检测,吖啶酯标记化学发光免疫测定示意图,ACS：180 SE和ACSCENTAUR化学发光免疫分析仪,ACS：180 SE,ACSCENTAUR,ci8200,i2000sr,酶联发光免疫分析仪是用参与催化某一化学发光或荧光反应的酶来标记抗原或抗体，在抗原抗体反应后，加入底物(发光剂)，由酶催化和分解底物发光，通过光信号的强弱来进行被测物的定量。 常用的标记酶有辣根过氧化物酶（HRP）和碱性磷酸酶(ALP)，常用的发光底物有鲁米诺、AMPPD和4-MUP等。,二、酶联发光免疫分析仪,该仪器采用辣根过氧化物酶（HRP）标记抗原或抗体、以塑料锥形小管为固相载体，鲁米诺为化学发光剂，还利用增强剂使化学发光强度增加、时间延长。,辣根过氧化物酶标记的化学发光免疫分析仪,鲁米诺是一种还原剂，在碱性溶液中被H2O2氧化产生鲁米诺衍生物（激发态）。它以光量子辐射形式返回基态时，发出微绿色可见光。,鲁米诺增强化学发光的原理,辣根过氧化物酶标记的化学发光免疫测定示意图,Vitros ECi全自动增强化学发光酶免分析仪, 碱性磷酸酶标记的化学发光免疫分析仪,该仪器是以碱性磷酸酶标记抗原或抗体，以顺磁性微粒子为固相载体，用AMPPD作为化学发光剂进行测定的自动化仪器。,AMPPD发光反应原理示意图,抗原抗体结合 洗涤、分离 加入AMPPD发光剂 信号检测,仪器测定技术要点,碱性磷酸酶标记的化学发光免疫测定示意图,Access全自动酶标记化学发光免疫分析仪,UniCelDxI 800,IMMULITE 2000型全自动酶标记化学发光免疫分析系统,（三）碱性磷酸酶标记的微粒子荧光免疫分析仪,该仪器以碱性磷酸酶标记抗原或抗体，以塑料微粒为固相载体包被抗体（或抗原），以4-甲基伞型酮磷酸盐（4-MUP）作为酶促反应的荧光基质（底物），底物被酶水解后，脱磷酸根基团，形成4-甲基伞型酮(4-MU)，用360nm激发光照射，发出450nm的荧光。,4-甲基伞型酮磷酸盐（4-MUP）反应原理示意图,仪器测定技术要点,抗原抗体结合 洗涤、分离 加入底物4-MUP 信号检测,碱性磷酸酶标记的微粒子荧光免疫测定示意图,AXSYM全自动酶标记荧光免疫分析仪,AIA-1800型全自动酶标记荧光免疫分析仪,电化学发光免疫分析（ECLIA）是一种在电极表面由电化学引发的特异性化学发光反应，它包括电化学和化学发光两个过程。电化学发光免疫分析仪是采用电化学发光技术，生物素放大技术，以顺磁性微粒为固相载体，用三联吡啶钌标记抗原或抗体，三丙胺(TPA)为电子供体，而设计的一种自动化分析仪器。电化学发光稳定、持续时间长，易于控制并可根据待测分子的大小设计成多种反应模式如夹心法、竞争法等。,三、 电化学发光免疫分析仪,电化学发光剂发光的反应原理,三联吡啶钌Ru(bpy)3 2+分子结构图,时间分辨荧光免疫分析仪是用镧系元素标记抗原或抗体作为示踪物，与时间分辨测定技术结合而制造出来的一种自动化分析仪。荧光偏振免疫测定是一种均相荧光免疫测定法，常采用抗原抗体竞争反应原理，适用于小分子半抗原（如药物浓度）的检测。全自动酶联免疫分析仪是由多个模块组成，用一台计算机、一套操作系统实现了从标本稀释、加样到酶标板孵育、洗涤、加试剂、再孵育、洗涤、酶标板读数和结果打印自动化。其结果是减轻了劳动强度，缩短了试验时间，提高了工作效率，为全面实现实验室自动化打下了基础。,磁性微粒直径2.8m，表面的凸凹使包被面积放大。磁性微粒体积小，悬浮于反应体系中，形成均一稳定的液相，在磁场中易于分离。,仪器测定技术要点,抗原抗体结合 电化学发光反应 光信号检测 检测完毕,电化学发光免疫测定示意图,电化学发光免疫测定工作示意图,AMPPD特性,碱性PH环境下，非酶解性的水解很低热稳定性好PH9时酶解速度最快，PH9.5时信噪比最低发光为持续型，15min达到高峰，60min内强度维持不变,相对发光单位,00 5 10 55 60,时间（分钟）,发光图谱连续，稳定。 允许多次记数，取均值作为结果。,AMPPD发光图谱,ACCESS分析简要流程,ACCESS,专利，独有技术磁性微粒子技术：d7 超声波清洗系统：交叉污染率300台 150台开展项目 42 25 38连续检测数 600 260 300消耗品随机更换 可 不可 不可试剂稳定性 1年 3个月 1年试剂定货周期 1周 1月以上 3月以上试剂上机保存时间 到效期 8H 4周性能价格比 高 低 中,高特异经典免疫学原理，单克隆抗体技术大分子采用夹心法分析小分子采用竞争法分析专利的磁性分离技术,ACCESS 系统特点,高灵敏采用最灵敏、最稳定的ALP-Dioxetane放大系统采用最持久最稳定的发光剂AMPPD 采用磁性微粒子技术(d7) 扩大包被面积以TSH为例， 检测限达0.003IU/ml，为第三代TSH,ACCESS 系统特点,高稳定发光信号稳定，持续高质量原厂试剂, 无需预处理稳定，持久的标准曲线，有效期长达28天以上机上试剂冷藏系统，试剂3度保存，有效期长多层覆膜试剂盒，确保试剂稳定,ACCESS 系统特点,高准确超灵敏光电倍增管检测发光信号发光稳定后，记录10次/s，取均值为结果超声波清洗系统，严格防止交叉污染(1ppm)系统自动QC管理 (Levy-Jennings),ACCESS 系统特点,ACCESS 系统特点,全自动，连续，任选，随机式检测速度100测试/小时，第一个结果需15分钟利用条码连续加入标本，一次上机60个，运行中 利用条码连续加入试剂，一次上机24个，运行中不停机加入各种耗品，耗品预警功能24小时待机，确保急诊检测 HCG; Myoglobin; Troponin计算机控制，形象化软件，Host Query功能,ACCESS 试剂项目,心血管动力学 Accu TnI糖尿病甲状腺激素 第三代TSH血液病毒 内分泌系统 性激素感染性疾病贫血肿瘤因子 游离PSA过敏原代谢疾病治疗药物监测,可用于内分泌激素类、肿瘤标志物类、心肌标志物类、病毒标志物类、治疗性药物浓度、骨代谢指标和贫血类等方面的检测，是目前免疫化学应用最为广泛的新技术。,四、在临床免疫检测中的应用,第三节 自动化荧光免疫分析系统,荧光免疫自动化分析主要是将抗原抗体结合反应与荧光物质发光分析和计算机技术有机结合的一项自动化免疫分析技术。根据抗原抗体反应后是否需要进行固相分离，分为均相和非均相两类。非均相荧光免疫测定主要有时间分辨荧光免疫测定法；均相荧光免疫测定主要有荧光偏振免疫测定法。,时间分辨荧光免疫测定（time resolved fluorescence immunoassay, TRFIA）是以镧系元素标记抗原或抗体作为示踪物，并与时间分辨测定技术相结合，建立起来的一种新型非放射性微量分析技术，具有灵敏度高，镧系元素发光稳定，荧光寿命长，不受样品自然荧光干扰，标准曲线范围宽等特点，已在临床实验室广泛使用。,一、时间分辨荧光免疫分析仪,Eu3+元素激发光谱和发射光谱之间的stokes位移,（一）、原理,时间分辨Eu3+元素荧光信号测量示意图,（二）仪器测定技术要点, 抗原抗体结合 加入Eu3+螯合抗体 加入酸性增强液 4. 信号检测,固相双抗体夹心TRFIA检测过程示意图,增强液(enhancement solution)，使Eu3+抗体抗原复合物的PH值降低至23，以利于Eu3+从复合物上完全解离下来，游离的Eu3+为增强液中的另一种螯合剂所螯合，在协同剂等其它成分的作用下，与增强液中的-二酮体生成一个Eu3+在其内部的保护性胶态分子团，这是一个新的具有高强度荧光的稳定螯合物，它在紫外光的激发下发射很强的荧光，信号的增强效果可达上万倍，该技术使用了解离增强步骤，并且采用了前后两种不同的螯合剂，前一种用于Eu3+与抗体标记，后一种用于与解离下来的Eu3+螯合成新的强荧光发射分子，因此，又将该技术称为解离增强镧系元素荧光免疫(dissociation-enhanced lanthanide fluoroimmunoassay, DELFIA),（三）解离增强原理：,auto DELFIA全自动时间分辨荧光免疫检测系统,1. TRFIA分析用的酸性增强液易受环境、试剂、容器等里面的镧系元素污染，使本底升高，所用试剂和器材应尽量防尘。 2.TRFIA分析用载体最常用的是聚苯乙烯微96孔板，其荧光本底低，并有洗涤微孔板的自动装置，但不同厂家生产的微孔板，所产生的荧光有很大差异，应选择应用。,（四）注意事项,荧光偏振免疫测定(fluorescence polarization immunoassay，FPIA)，为一种均相荧光免疫测定方法，其利用荧光物质在溶液中被单一平面的偏振光照射后，可吸收光能而产生另一单一平面的偏振发射荧光，该荧光强度与荧光 标记物质在溶液中旋转的速度与分子大小呈反比，常采用抗原-抗体竞争反应原理，适用于小分子半抗原（如药物浓度）的检测。,二、荧光偏振免疫分析仪,光的本质是电滋波，光是各个方向电滋波的混合物，当光线通过偏振滤光片后，形成只有一个方向的电滋波，称之为偏振光。荧光物质经单一平面的偏振光（蓝色光，485nm）激发后，可吸收光能跃入激发态，在其恢复至基态时，释放能量并发射出单一平面的偏振荧光（绿色光，525nm550nm） 。偏振荧光强度与荧光物质分子在液相中转动的速度呈反比，即分子大转动速度慢，荧光强度大，分子小转动速度快，荧光强度小。,(一) 原理,偏振光和偏振荧光发生示意图,荧光偏振免疫测定工作原理示意图,1. 抗原抗体反应 2.偏振荧光强度测定,（二） 仪器测定技术要点,1.FPIA的结果好坏取决于荧光素标记的好坏、激发态荧光的平均寿命、抗原的相对分子量和复合物的特性等因素。2.为提高FPIA灵敏度，可用除蛋白剂对标本进行预处理，除去干扰成分。,（三）注意事项,第四节 自动化酶联免疫分析系统,根据全自动酶联免疫分析系统的处理模式，人们通常将全自动酶免分析仪分成二类，一类为分体机，一类为连体机。分体机是由“前处理系统”即全自动样本处理工作站和“后处理系统”即全自动酶免分析仪两个独立的部分组成。连体机是由多个模块组成，使用一台计算机、一套操作系统实现了从标本稀释、加样到酶标板孵育、洗涤、加试剂、再孵育、洗涤、读数和结果打印全自动进行。,（一）仪器组成和性能,1.条形码识别系统 2.样本架和加样系统 3.试剂架 4.温育系统,5.液路系统 6.洗板系统 7. 酶标板读数仪 8.自动装载传递系统 9. 计算机管理和信息系统,全自动酶免分析仪中的连体机是将样本处理工作站和全自动酶免分析仪联合起来，工作速度快，自动化程度高，适合大批量样本的处理，如血站系统。分体机，由于它有一个独立的全自动样本处理站，加样速度快，适合试验项目变化多、样本批量不等的临床实验室。,（二）仪器评价,采用流水线式操作,加样,洗板,常用英语单词,Reagent :试剂Sample：标本Calibration：校准，定标Maintenance：维修，保养Alarm:报警Rack：试管架,1. 什么是免疫检验自动化？应用哪些技术？优点是什么？2. 免疫浊度分析的原理是什么？有哪些临床应用？3. 免疫胶乳比浊法和免疫散射比浊法的原理是什么？4. 定时散射比浊法和速率散射比浊法的测定原理，其抗原过量检测有什么不同点？5. 免疫比浊分析的影响因素有哪些？6. 吖啶酯标记的化学发光免疫分析仪技术要点是什么？7. 酶联发光免疫分析仪的原理，有哪几种类型？各有什么特点？8. 电化学发光免疫分析仪测定的技术要点是什么？9. 时间分辨荧光免疫分析仪测定的技术要点是什么？注意事项有哪些？10. 全自动酶免分析仪的组成成分有哪些？优点是什么？,思考题,免疫检验自动化是将免疫检验过程中的取样、加试剂、混合、温育、固相载体分离、信号检测、数据处理、打印报告和仪器清洗等步骤由计算机控制，仪器自动化进行。定时散射比浊法是在保证抗体过量的情况下，加入待测抗原，在抗原抗体反应的第一阶段，溶液中产生的散射光信号波动大，所获取的信号不稳定，定时散射比浊法避开这一阶段，专门测定抗原抗体反应的最佳时段，使检测误差降到最低。,小结,吖啶酯标记的化学发光免疫分析仪是一种用发光剂直接标记抗体或抗原，以磁性微粒为固相载体的一种免疫分析法，吖啶酯发光只需加入氧化剂和pH纠正液，不需要酶催化。酶联发光免疫分析仪是用参与催化某一化学发光或荧光反应的酶来标记抗原或抗体，在抗原抗体反应后，加入底物(发光剂)，由酶催化和分解底物发光，通过光信号的强弱来进行定量。,