电化学发光免疫分析法课件

化学发光免疫分析法,Chemiluminescence Immunoassay,免疫分析,基于抗原和抗体的特异性反应进行检测的一种手段； 免疫标记技术是将一些既易测定又具有高度敏感性的物质标记到特异性抗原或抗体分子上，通过这些标记物的增强放大效应来显示反应系统中抗原或抗体的性质与含量。,免疫学检测历史演进,放射免疫检测（兴起于20世纪70年代，现仍普遍使用于县级以上医院）； 酶联免疫检测（兴起于20世纪80年代，各临床机构普遍使用）； 以化学发光为代表的光生物学标记及免疫检测技术（20世纪90年代开始推广使用，产品步入成长期）三个阶段。,生活中常见的化学发光现象,发光分类,光照发光（荧光）:发光剂经短波长入射光照射后进入激发态，当回复至基态时发出较长波长的可见光。 生物发光：反应底物在荧光素酶的催化下利用ATP产能，生成激发态的氧化荧光素，后者在回复到基态时多余的能量以光子形式放出。 化学发光,化学发光 Chemiluminescence (CL),化学发光是指在某些特殊的化学反应中，反应的中间体或产物由于吸收了反应释放的化学能而处于电子激发态，当其回到基态时伴随产生的光辐射现象。,化学发光原理,所谓化学发光 (CL) , 就是化学反应的能量把体系中共存的某种分子从基态激发到激发态从而产生发光的现象。,化学发光的分类,直接化学发光 A + B C* + D C* C + h 例: NO + O3 NO2* + O2 NO2* NO2 + h,化学发光的分类,间接化学反应发光 A + B C* + D C* + E E* + C E* E + h,化学发光免疫技术中常用的化学发光剂或发光底物,酶促反应的发光底物 直接化学发光剂 电化学发光剂,1酶促反应的发光底物,酶促反应的发光底物是指经酶的降解作用而发出光的一类发光底物，目前化学发光酶免疫技术中常用的酶有辣根过氧化物酶（HRP）和碱性磷酸酶（ALP），相应发光底物为：,(1) HRP的发光底物,常用的底物为鲁米诺或其衍生物和对-羟基苯乙酸。 鲁米诺或其衍生物 鲁米诺的氧化反应在碱性缓冲液中进行，通常以0.1mol/L pH8.6 Tris缓冲液作底物液。,H2O2 /OH HRP,+N2 + H2O +光, HPA在H2O2存在下被HRP氧化成氧化二聚体（荧光 物质），在350nm激发光作用下，发出450nm波长 的荧光，可用荧光光度计测量。,H2O2 HRP,+荧 光,氧化二聚体,（2）ALP的发光底物,常用的底物为3-（2-螺旋金刚烷-4-甲氧基-4-甲基-4-（3-磷酸氧基）-苯基-1，2-二氧乙烷（AMPPD）和4-甲基伞形酮磷酸盐（4-MUP，荧光底物）。,AMPPD,AMPPD在碱性条件下，被ALP酶解生成相当稳定的AMP-D阴离子，其有2-30min的分解半衰期，发出波长为470nm的持续性光，在15min时其强度达到高峰，15 60min内光强度保持相对稳定。,光,AP /OH HPO4 2,4-MUP,4-MUP在ALP催化下生成4-甲基伞形酮，在360nm激发光的作用下，发出448nm的荧光，用荧光光度计进行测量。,荧光,AP,H3PO4 +,360nm 激发光,CAP TODAY调查结果-Mar. 2003,全自动免疫分析系统全球市场占有率,ChemiflexTM 效应,Sulfupropyl Derivative 稳定性组分 极其稳定,10月效期, 30 天上机, 最少30 天校正曲线,Nitrogen Bond (吖啶Sulfonamide Group) 稳定性组分产生巨大的光 (50% more) 优异的灵敏度和线性范围 (TSH 0.008 uIU/mL),专利的化学发光标记物,提升检测功能灵敏度 增加检测线性范围 降低定标频率 延长试剂效期,专利的稳定(sulfopropyl)基团,专利的发光(sulfonamide)基团,ARCHITECT 使用pre-trigger/trigger双重反应来提升和产生光信号,直接夹心法分析模式 磁微粒子上包被的抗体与分析物及专利的吖啶酯标记抗体结合,ARCHITECT HBsAg Assay Design,经过最后一步冲洗,磁微粒子上捕捉有免疫复合物,Pre-Trigger 被加入 Pre-Trigger使专利的吖啶酯标记物从固相载体上释放到溶液中,磁块吸附 磁微粒子被磁块吸附在反应杯的壁上,从而防止磁粒子对光信号检测的干扰,Trigger 被加入 提供一个碱性环境产生光信号,吖啶酯标记物 被释放产生光信号,产生的信号以Relative Light Unit (RLU)方式表达.,ARCHITECT 使用pre-trigger/trigger双重反应来提升和产生光信号,竞争法分析模式 分析物及专利的吖啶酯标记物与磁微粒子上包被的抗体竞争结合,Chemiflex 灵活的处理步骤,灵活的步骤,独有的化学发光,一步法 加样本+结合物 加固相 单步冲洗 读数,两步法 加样本+固相 一步冲洗 加结合物 两步冲洗 读数,预处理 加样本, 预处理 转移预处理液 加固相 一步冲洗 加结合物 两步冲洗 读数,分析设计的灵活性 分析设计并没有局限于一步法 新项目开展时间大大减少 超级分析表现 基于不同的测试, 应用不同的方法设计,Chemiflex,ARCHITECT分析项目,肝炎 乙肝表面抗原确证 乙肝表面抗原(定量) 乙肝表面抗体(定量) 乙肝核心抗体 乙肝e抗原 乙肝e抗体 丙肝抗体(第三代) 甲肝总抗体* 甲肝IgM抗体* 艾滋抗体* HTLV1/2抗体* 肿瘤标志物 甲胎蛋白 癌胚抗原 糖类抗原125* 糖类抗原153* 糖类抗原199 游离前列腺特异性抗原 总前列腺特异性抗原 Pepsinogen I(胃癌) B2-微球蛋白*,生殖/内分泌 总B人绒毛膜促性腺激素 促黄体生成素 促卵泡生成素 雌二醇 孕酮 睾酮 催乳素 雌三醇* 药物浓度监测 地高辛* 茶碱* 卡马西平* 苯巴比妥* 丙戊酸* 洋地黄* 庆大霉素* 万古霉素* 苯妥英钠* *待开发项目,甲状腺功能 三碘甲状腺原氨酸 甲状腺素 游离三碘甲状腺原氨酸 游离甲状腺素 超敏促甲状腺素 先天性疾病 风疹病毒IgG* 风疹病毒IgM* 弓型虫IgG* 弓型虫IgM* 巨细胞病毒IgG* 巨细胞病毒IgM* 梅毒* 代谢 铁蛋白 B12 叶酸 糖化血红蛋白 心肌钙蛋白-I* 肌酸激酶*,RSH-灵活的轨道系统,独特的三维立体设计提供连续和灵活运行模式 多色的闪烁灯提示操作员轨道状况,及时进行必要处理 急诊和重检样品优于常规样品的操作,最大限度减少紧急样品检测时间,急诊/优先样品架位,单个5个样本位的ARCHITECT样本架 7个样本架共有35个样本位 插入样本架后系统自动选择优先测试 指示灯直观显示架位情况,常规样品盘位,每个样本盘可放置5个ARCHITECT样本架共25个样本 i2000SR样本盘位数量为4个 样本架运行顺序为从左至右、先进先出 指示灯直观显示盘位情况,RSH-提高工作流程的效率,实验室样品的快速灵活分样是通过RSH和强大的Architect软件实现 自动稀释 自动重检 自动反射 样品架运输速度达0.9m/s加速度 两个样本间的吸样间隔2秒 急诊/优先样品3分钟完成分样 为将来生化和免疫的整合提供必要的条件,试剂通道,25个试剂位置 自动旋转,混匀试剂 试剂包装100和500人份 试剂冰箱,消耗品,反应杯容器 一次最多可放置1200个反应杯(RV) 可连续放置,RV杯的放置,智能化探针,不锈钢样品/试剂探针 有防撞功能设计 智能探针清洗模式(缓冲液,清洁剂和不同清洗模式) 探针自动定位校正 凝块,气泡和液面感应 25ul的死体积量,智能冲洗设计,冲洗模块(Wash manifold) 3针冲洗,干净彻底 相互独立 冲洗吸液监测(WAM) 在冲洗中进行温度感应监测 确保液体吸/放的正确,预激发液和激发液,抽送式设计,方便安放 大容量上机试剂 预激发液:3000测试,15小时离机时间 激发液:9000测试,45小时离机时间,预激发液,激发液,大瓶清洗液,上机缓冲液25升(1000T) 浓缩缓冲液(1:10) 系统自动抽入,浓缩洗液,固体废物的排放,反应杯干燥排放 可一次排放1000测试 15分钟的连续排放时间,Waste chute,确保废物更换,废液的排放,外接式液体排放 可下排 或接泵上排,Architect 操作软件,“形象化”的用户软件 图标操作 容易操作 远程诊断 机上操作手册 在线帮助 自动提醒和更新的保养手册,Architect 主菜单,Architect 保养手册,Architect i2000SR(免疫模块)可整合的仪器,Chemiflex TM专利技术 灵活步骤(一步,二步和预处理) 化学发光(高灵敏度,宽线性和高稳定性) 保证200 测试/小时 灵活的上样方式 135 个一次最大上样量 35 个急诊 /优先样品位 100 个常规样品位 原试管,血清管或样品杯 急诊分析 18分钟 自动稀释,重检,转测和预处理 25 个冷藏试剂位置 500 & 100 测试/盒 30 天上机稳定期 5 小时离机时间 图标式易操作软件 可与 c8000整合成 ci8200,ARCHITECT ci8200: 重要特点摘要,免疫生化检测的整合 速度 最高 200测试/小时（免疫） 最高1200测试/小时（生化） 运行能力 367条码识别样品管 冷藏试剂仓，免疫25个，生化68个 工作流程效率的提升 免疫，急诊18 分钟 自动重检/反射能力 无须样品分开 降低技术人员的劳动,压力凝块检测 携带率 0.1ppm,2直接化学发光剂,这类发光剂不需酶的催化作用，只需改变溶液的pH等条件就能发光，如吖啶酯（acridinium, AE）在含过氧化氢的稀碱溶液中即能发光。,3.电化学发光剂,是指通过在电极表面进行电化学反应而发出光的物质。化学发光剂三联吡啶钌Ru(bpy)32+（图19-1）和电子供体三丙胺（TPA）在阳性电极表面可同时失去一个电子而发生氧化反应。二价的Ru(bpy)32+被氧化成三价，成为强氧化剂，TPA失去电子后被氧化成阳离子自由基TPA+，它很不稳定，可自发地失去一个质子（H+），形成自由基TPA.，成为一种很强的还原剂，可将一个高能量的电子递给三价的Ru(bpy)33+使其形成激发态的Ru(bpy)32+.。激发态的三联吡啶钌不稳定，很快发射出一个波长为620nm的光子，回复到基态的三联吡啶钌。这一过程可在电极表面周而复始地进行，产生许多光子，使光信号增强,化学发光免疫分析 chemiluminescence immunoassay（ CLIA）,CLIA是将化学发光分析和免疫反应相结合而建立的一种新的免疫分析技术。 这种方法兼有发光分析的高灵敏度和抗原抗体反应的高度特异性。,免疫发光技术要点,包括抗原抗体反应 标记物游离部分和结合部分分离 发光反应及检测等三部分。,（一）抗原抗体反应,抗原抗体反应模式主要有以下三类。 1双抗体夹心法 2双抗原夹心法 3固相抗原竞争法,1双抗体夹心法,用固相抗体和酶标抗体与待测标本中相应抗原反应，生成固相抗体-抗原-酶标抗体复合物，经B/F分离，加入底物经酶促反应后发光，其发光量与待测标本中抗原含量呈正比。,2双抗原夹心法,该法常用于抗体的检测，用固相抗原和酶标记抗原与待测标本中相应抗体反应，生成固相抗原-待测抗体-酶标抗原复合物，经B/F分离，在免疫复合物中加入底物进行酶促发光，其发光量与待测标本中抗体含量呈正比。,3固相抗原竞争法,该法常用于多肽类小分子抗原的测定，用已知固相抗原和待测标本的相应抗原与一定量的酶标记抗体发生竞争性结合反应，反应平衡后经B/F分离，固相抗原与酶标抗体形成复合物被留下来，通过加入底物进行酶促发光反应，其发光量与待测标本中抗原含量呈反比。,（二）游离和结合部分分离,是将游离酶标记物和酶标记物免疫复合物进行分离过程，常用分离技术有： 1磁颗粒分离法 2微粒子捕获法 3包被珠分离法,1磁颗粒分离法,用抗原或抗体包被的磁颗粒与标本中相应抗原或抗体和酶标的抗体或抗原通过一定模式的免疫学反应后,最终通过磁场将结合酶标记物免疫复合物和游离酶标记物进行分离的技术。,2微粒子捕获法,与磁颗粒分离法所不同是所用颗粒是无磁性的微粒子作为抗体或抗原的包被载体, 然后用纤维膜柱子进行酶标记物的结合状态和游离状态的分离。,3包被珠分离法,将用聚苯乙稀等实验材料制成小珠, 在小珠上包被抗原或抗体,经抗原抗体反应后,将结合状态和游离状态的酶标记物进行分离。,（三）化学发光和检测,以荧光酶免疫分析为例，加入底物4-MUP，酶标抗体上ALP将4-MUP分解，脱磷酸根基团后形成4-甲基伞形酮（4-MU），它在360nm激发光的照射下，发出448nm的荧光，经荧光读数仪记录，放大，最后根据标准曲线由电脑计算出所测物质的含量。,电化学发光（ECL),电致化学发光 (ECL) 是通过在电极上施加一定波形的电压或电流信号进行电解反应的产物之间或与体系中共存组分反应产生化学发光的现象。 ECL与CL的差异在于ECL是电启动发光反应，而CL是通过化合物混合启动发光反应。因此ECL反应易精确控制，具有灵活性。,电化学发光剂,定义：指通过在电极表面进行电化学反应而发出光的物质。 特点 反应在电极进行 化学发光剂：三联毗啶钌 电子供体为：三丙胺（TPA）,三联毗啶钌分子结构图,三联吡啶钌 （ Ru(bpy)32+ ）特点,ECL分析中采用Ru(bpy)32+作为标记物，其活化衍生物是Ru(bpy)32+N羟基琥珀酸胺酯（NHS） ，该衍生物具有水溶性，且高度稳定，保证电化学发光反应的高效和稳定，而且避免了本底噪声的干扰。,三联吡啶钌（ Ru(bpy)32+ ）特点,Ru(bpy)32+衍生物与免疫球蛋白结合的分子比超过20仍不会影响抗体的可溶性和免疫活性； Ru(bpy)32+分子量小，空间位阻小 ，即便小分子的核酸也能标记，使检测的菜单大大丰富，更重要的是为其检测菜单的开发前景提供了广阔空间。,电化学发光原理图,基态,激发态,不稳定,电化学发光免疫分析 (Electro-Chemiluminescence Immunoassay, ECLI),ECLI是继EIA、RIA、FIA、时间分辨荧光免疫技术（TRFIA）之后的新一代标记免疫测定技术； ECLI是电化学发光(ECL)和免疫测定相结合的产物； ECLI是目前最先进的标记免疫测定技术之一。,ECLI原理,在电极表面由电化学引发的特异性化学发光反应，用电化学发光剂三联吡啶钌Ru(bpy)32+标记Ab，通过Ag-Ab反应和磁珠分离技术，根据三联吡啶钌在电极上发出的光强度对待测的Ag或Ab进行定量/定性。,ECLIA检测流程图一（双抗体夹心的形成）,ECLIA检测流程图二 （生物素与亲和素结合）,ECLIA体系结构图,ECLIA检测流程图三 （磁珠吸引吸附于电极表面）,ECLIA检测流程图四 （电极充电启动电化学反应）,ECLIA检测流程图五 （撤消磁场冲洗磁珠）,方法评价,采用的固相载体是带有磁性的直径约2.8 m的聚苯乙烯微粒。其特点是反应面积比板式扩大2030倍，吸附效率高；在液体中形成均匀的悬液，参与反应时类似液相，反应速度大大加快；,方法评价,“链霉亲和素-生物素”是是具有很强的非共价相互作用的一对化合物，具有牢固而特异的结合，应用此放大系统，使检测的灵敏度大大提高；,方法评价,利用氧化铁的磁性，使用电磁场分离结合态和游离态，方便迅速，实现了精确的全自动化； 标记物的再循环利用，使发光时间更长、强度更高、易于测定。,ELIA优越性,高度敏感，可达pgml或pmol水平； 特异性强，重复性好，CV5。 测定范围宽，可达7个数量级。 试剂稳定，无毒害，无污染，有效期长，达数月甚至数年。 操作简单，耗时短，易于自动化。 在对环保很重视的国家，CLIA成了取代RIA的首选方法。,临床应用,激素 肿瘤标记物 内分泌功能 传染性疾病 其它 如VB12、叶酸、铁蛋白、肌钙蛋白、肌红蛋白、酶、脂肪酸、维生素和药物等多种检测项目。,谢谢！,