rna干扰载体的构建的实验流程(1)

RNA 干扰载体的构建的实验流程RNA干扰载体主要用来研究基因表达调控，RNA干扰技术已已被 广泛用于基因结构功能研究和传染性疾病及基因治疗领域，进行RNA 干扰实验首先是构建RNA干扰载体，本文以pRI系列载体为例论述了 干扰载体的构建的实验流程。产品技术背景pRI系列载体是基于III类rna聚合酶启动子：人类H1启动子 的专用于哺乳动物细胞RNA干扰的载体。H1启动子在哺乳动物细胞 内合成类似siRNA分子的小分子RNA。由于H1启动子有精确的转录 起始位点和终止信号，H1启动子转录产物精确生成人工设计的 shRNA, shRNA经过RISC剪切后形成有2个U突出末端的成熟siRNA。 由于H1启动子对转录产物长度的严格限制，基本上杜绝了非特异性 干扰片段的产生，将载体转染细胞后对其它基因的影响降到最低。pRI系列载体已经成功用于多种哺乳动物细胞进行基因的RNA干 扰。本系列中含有新霉素抗性基因的载体用于稳定表达siRNA，可以 在更长时间内对基因表达抑制后的细胞功能和生理现象进行观察和 分析。插入寡核苷酸设计pRI系列载体的使用需要将人工设计的寡核苷酸片段插入pRI系 列载体中特定的酶切位点之间，寡核苷酸片段中包含了针对目标基因 的mRNA设计的长度为19nt的干扰片段。合成时需要化学合成正向和反向两条寡核苷酸。正、反向寡核苷 酸退火后与载体连接，插入载体Xhol, Bglll位点之间，位于载体上 H1启动子下游正确的位置上。连接后的载体转入哺乳动物细胞在H1 启动子作用下转录产生shRNA。1. 选择干扰序列在RNA干扰实验中，RNA干扰序列的选择会显著影响RNA干扰效 果。我们建议您按照以下几点指导原则选择RNA干扰序列：推荐长度为19 nt，采用21 nt序列也可以取得良好效果。RNA干扰序列中不包含大于3 nt的连续相同碱基。RNA干扰序列的GC含量为低到中等水平（推荐GC含量在35%到 50%之间）。不要将RNA干扰序列设计在已知的RNA-蛋白质结合位置附近。确保RNA干扰序列与其它基因没有较高的同源性。方向：在编码mRNA的正义链上选择RNA干扰序列。设计RNA干扰序列是RNAi实验的关键。这里提供的设计原则可 以为您设计RNA干扰序列提供帮助。但是，值得注意的是，遵循这些 原则不能确保设计的RNA干扰序列对目标基因有好的抑制效果。针对 一个目标基因，我们建议您至少设计3条干扰序列并且从中筛选出干 扰效果好的序列。2. 寡核苷酸设计。（1）设计正义寡核昔酸链（5 -3方向）。a）5 TCGACCCb）19nt干扰序列正向序列（与目标mRNA 一致）。c）TTCAAGAGA（环状结构）。d）19nt干扰序列的反向互补序列。e）TTTTTo（2）设计反义寡核昔酸链（5 -3方向）。a）去掉正义链寡核昔酸中5 TCGAb）将步骤a）中得到的序列做反向互补。c）在步骤b）中得到的序列的5端加上碱基GATCo一个设计好的例子见下图：实验流程概述：以下为使用pRI载体的方法概述。1. 将合成的正义和反义寡核昔酸链退火。2. 用Bglll和Xhol双酶切载体。3. 将退火的寡核昔酸链与酶切后的线性载体连接。4. 连接产物转化大肠杆菌。5. 转染细胞。6. 观测荧光表达（含有GFP的载体）或筛选稳定表达细胞（含 有抗性的载体）。7. 检测目标基因蛋白或mRNA表达水平载体构建对于实验中的很多步骤，您可以使用您实验室中常用的方法，或 者您的实验经验证实有效的方法。对于酶切、DNA纯化以及转化等步 骤，您可以参照分子克隆实验指南进行，也可以参照您购买的试 剂盒中生产商提供的使用说明进行。步骤仁退火寡核昔酸链根据我们的经验，脱盐纯化的寡核苷酸足以满足连接和克隆需 要。但是不同供应商提供的引物纯度差别很大，如果您连接和克隆遇 到困难，可以考虑换用PAGE纯化或HPLC纯化的引物，或者使用其他 供应商提供的引物。用水将寡核苷酸稀释为100 U M。按以下体系配制退火反应体系:正义寡核苷酸(100 UM) 5 u l反义寡核苷酸(100 UM) 5 u lNaCI 100 mMTris-CI 50 mM加水补足50 u I将配制好的退火反应缓冲液重复混合，短暂离心后放置PCR以 上，运行以下程序：90 C 4 min, 70 C 10 min, 55 C 10 min, 40 C 10mi n, 25 C 10 mi n。退火后的寡核苷酸可以立刻使用或者 在-20 C长期保存。步骤2：酶切载体用Xhol和Bglll双酶切2 ug载体。酶切方法和体系参照您购 买的内切酶说明书或者按照您的实验室习惯的方法进行。通常情况下用大约20-30单位的酶在大约3小时可以酶切完全。酶切后我们建议用琼脂糖凝胶回收线性化载体。将回收后的载体 体积稀释为30 |11。对线性化的载体进行去磷酸化处理是没有必要的。充分酶切后的 载体具有不匹配的末端，一般不会发生载体自连。步骤3：连接载体用水将退火后寡核苷酸稀释100倍备用。按照以下体系配制连接 反应体系：T4 DNA连接酶5 U线性化载体2 n l稀释后寡核苷酸2 n l10X连接酶 Buffer 1 |d l加水补足10 111接连反应条件和时间参照您购买的连接酶说明书进行。为了减少空载体自连，连接反应完成后，在连接反应体系中加入1 1 l Bglll, 37 C反应30 min,切割连接上的空载体。（选做）步骤4：转化大肠杆菌感受态用连接后产物转化大肠杆菌感受态细胞。市场上常见的大肠杆菌 感受态细胞（例如Top10, DH5-a）均可以使用，您也可以按照分子克隆中的方法自己制备感受态细胞。转化方法按照供应商的说明书或者 您实验室中常用的方法进行。在氨苄抗性的琼脂平板上37 C培养转化后细菌，大约14-16小 时后，平板上出现单个细菌菌落。挑取多个菌落至氨苄抗性的培养基 中培养后进行鉴定。鉴定方法可以采用PCR鉴定或酶切鉴定。PCR 鉴定采用引物 M13F (TGTAAAACGACGGCCAGT)和 M13R-48(AGCGGATAACAATTTCACACAGGA)进行鉴定，空载体扩增产物长 度为308 bp，阳性克隆扩增产物为361 bp。酶切鉴定采用Hindlll和EcoRI双酶切。空载体酶切产物长度为 235 bp,阳性克隆酶切产物长度为288 bp。鉴定正确的克隆可以用引物M13R-48测序验证插入的寡核苷酸 序列是否正确无误。步骤5：转染细胞pRI系列载体可用常用的转染方法进行细胞转染。包括：磷酸钙 转染、脂质体转染、电穿孔转染等。您可以购买市售的商品化转染试 剂并且参照供应商说明书进行细胞转染实验。步骤6：观测GFP荧光和稳定表达细胞系筛选如果细胞转染成功，并且您使用了带GFP的载体，根据细胞生长 速度的不同，在转染后3-5天能在荧光显微镜下观察到细胞发出绿色 荧光。请注意，绿色荧光蛋白的表达表明转染细胞成功，不能说明 RNA干扰实验成功。如果您使用了带有真核抗性标签如Neo-R的载体，这时您可以加 入合适浓度的相应药物如G418进行稳定表达细胞株的筛选。步骤7：检测RNA干扰效率您可以在蛋白水平或mRNA水平检测RNA干扰效率。一般情况下 蛋白的表达变化与mRNA水平的表达变化一致，也有少数情况下mRNA 表达水平变化不及蛋白表达下降明显。为检测蛋白表达情况，您可以使用Western-Blot。为检测mRNA表达情况，您可以使用逆转录+Realtime PCR或 Northern-Blot。具体检测方法请参照分子克隆使用指南或者您实验室的常用实 验方法。疑难问题遇见RNA干扰效果不理想，可以参考以下问题：1. 寡核苷酸合成设计错误的核苷酸较多，致使序列与设计不 符。建议做转染之前对载体进行验证，可以通过酶切以及测序进行测 试。2. 如果细胞转染效率不高，建议加入GFP进行标记检测。