《常规病理学技术》PPT课件.ppt

病理学技术概论 及常规病理技术,南方医科大学病理学系 申 洪,课程简介,内容：着重介绍重要的病理学技术及其应用 目的：提供病理学研究所需的基本技术知识 体系和病理学研究的一些基本思路；,课程结构：,常规病理学技术 细胞病理学技术及其在肿瘤病理学中的应用 电镜技术及其在病理学中的应用 定量病理学技术及其在病理学中的应用,基本要求,基本概念 基本原理 基本方法和技术关键 联系实际，思考应用,一、病理学技术概念范畴,1 病理学 2 病理学技术 广义概念 狭义概念：围绕病理形态学,病理形态学技术类型, 尸体剖验技术 常规组织病理学技术 常规细胞病理学技术 组织化学和细胞化学技术 免疫组织化学技术 流式细胞技术 超微结构技术 体视学技术： 定量病理学技术 图像分析技术 分子病理学技术 激光共聚焦显微镜 动物实验技术 三维重建技术 细胞培养技术,一、尸体剖验技术,目的意义：查出病因和病变，明确诊断及死因 解释临床症状和体征等临床现象 及时发现和确诊新疾病，特别是传染病 提供第一手科研材料 法律手续：死者家属签字 临床医生签字 单位签字 基本要求：研究生：参加病理解剖 本科生：见习,二 常规病理学技术,组织取材及固定技术 包埋 石蜡切片技术 冰冻切片技术 HE染色,标本的来源与收集 1、临床活检 2、尸体解剖 3、实验动物 注意事项 1、检查申请单的姓名，标本的件数是否与之相符合。 2、标本是否符合要求。,（一）取材、固定,标本的来源与收集 1、临床活检 2、尸体解剖 3、实验动物 注意事项 1、检查申请单的姓名及标本件数是否相符。 2、标本是否符合要求。,取材：,切取病变组织或拟研究的组织 及时，尽可能新鲜 迅速固定、冷藏 生理盐水、磷酸缓冲液等溶液 刀要快，不要挤压组织 注意研究目的 培养 定量 对比观察 临床诊断,固 定,（一）固定：用化学试剂保持尸体、器官、组 织结构和细胞结构的固有形态结 构的过程谓固定，所用的化学试 剂谓固定剂或固定液。 目的：防止自溶、腐败，保持良好结构 原理：组织及细胞内蛋白凝固，或使有 关成分沉淀、变性，成为不溶性 物质。 方法：浸泡 灌注：局部灌注、全身灌注 蒸汽熏蒸,固定时间: 常规组织病理学: 可长时间固定 细胞病理学：可长时间固定 细胞化学：不宜过长，约1小时为宜 固定后处理： 充分洗涤 固定时间越长，洗涤时间也应相应增加,固定注意事项,1. 固定液有毒性，注意自身防护 2. 及时，尽可能新鲜 3. 超微结构观察：低温固定 4. 注意不同研究目的对固定液的特殊需要 细胞化学 超微结构 细胞涂片巴氏染色 5. 固定液用量：足，必要时及时更换。 6. 固定时间 7. 固定后洗涤,常用固定液,甲醛溶液：4甲醛，或 10福尔马林 40甲醛（福尔马林，Formeldehyde） 用于无特要求的组织常规固定 乙醇（Ethyl Alcohol）: 95% 用于细胞病理学涂片常规固定，糖原固定 乙醇乙醚混合固定液: 95% ： 95%乙醇+ 95%乙醚（1:1） 用于细胞涂片巴氏染色,（二）石蜡包埋制样,组织块脱水： 逐级乙醇脱水 透明：二甲苯 浸蜡：65C 包埋：溶解蜡,人工脱水程序 (适应于3mm厚的组织块),1、30%酒精 24h 2、50%酒精 24h 3、70%酒精 24h 4、80%酒精 24h 5、90%酒精 12h 6、95%酒精 4h 7、95%酒精 4h,8、100%酒精 2h 9、100%酒精 2h 10 二甲苯 40min 11 二甲苯 40min 12 石蜡（软） 1h 13 石蜡 1h 14 石蜡 1h,（三）石蜡切片,(四) HE染色：苏木素伊红染色,1 脱蜡 （二甲苯） 2 水化 （逐级乙醇水化：10030） 3 染苏木素 4 1盐酸酒精分化 返兰 逐级乙醇脱水 30 (或50) 95 伊红染色 逐级乙醇脱水 （95100） 二甲苯透明 封片：中性树胶盖玻片,HE染色法程序,三、常规细胞病理学技术, 细胞病理学（cytopathology） 诊断细胞学（diagnostic cytology） 临床细胞学（clinical cytology）。 该学科是利用身体器官组织正常或病变的离体细胞进行涂片，经显微镜观察，做出疾病诊断，特别是肿瘤良恶性诊断. 细胞病理学方法简便易行、诊断准确、可靠，已成为癌症早期诊断的重要手段之一，可广泛应用于临床和大量人群防癌普查。,三、常规细胞病理学技术, 一、取材、涂片制备 痰涂片、胸水、腹水及尿液制片 二、固定 三、染色 (巴氏染色),常用固定液,（1）等量95%乙醇和乙醚混合液 （2）氯仿酒精固定液 （3）95%酒精固定液 （4）福尔马林固定液 细胞学研究，固定液选择要根据实验要求条件而定，如用细胞涂片作原位PCR，固定液要选用多聚甲醛。,巴氏染色步骤,1标本95酒精固定3-5分钟 2Harris苏木素液5-10分钟 3水（蒸馏水或自来水）漂洗2-3次 41盐酸水溶液（或1盐酸酒精液） 浸1-3次 5自来水浸洗1-2次 6自来水或稀碳酸锂（100ml蒸馏水中加碳酸锂饱和液1滴），涂片返蓝为止,7依次置入708095酒精， 各2分钟 8桔黄G6液，1分钟 995酒精、缸，各1分钟 10EA36液，5分钟 1195酒精、，各1分钟 12无水酒精、，各1分钟 13二甲苯、，各2分钟 14中性树胶盖片封固,四、组织化学和细胞化学技术,用化学反应原理，在切片上滴加某种化学试剂，使之与组织或细胞中的生物化学物质结合，再用显色剂使之显色，达到定位、定性地显示组织或细胞中的某种物质成分，这种技术称为组织化学和细胞化学技术。其结果可用显微镜和电镜观察。结合定量病理学技术，还可对有关成分定量。,应 用, 糖类 脂类 核酸 酶类 胶原纤维 弹力纤维 神经纤维 细胞膜、核膜结构,五、免疫组织化学技术,概念：免疫组织化学技术是指利用已知的抗 体与组织中相应的抗原结合，并利用 显色剂在原位将抗原物质显示出来 原理：抗原抗体显色剂 特点：在组织中原位显示某种特异性抗原 常用显色剂种类：酶、金属粒子、同位素 生物素、化学显色剂（DAB） 结果观察：显微镜、透射电镜,六、超微结构的基本技术,超微结构是在高分辨条件下观察到的细胞膜、细胞核、核仁、核膜、各种细胞器、微绒毛、纤毛、细胞连接结构及胶原纤维、弹力纤维等光镜水平观察不到的细微结构。,（一）透射电镜技术,1. 取材：11mm3 2. 固定: 2%戊二醛 2h 1%锇酸 12h 3. 脱水：逐级丙酮，环氧丙烷 4. 包埋及聚合：浸透、包埋（Epon812） 聚合（硬化）、时间 5. 超薄切片：超薄切片机 6. 染色：饱和醋酸铀、1柠檬酸铅 7. 透射电镜观察,（二）扫描电镜技术,1. 取材：11mm3 2. 固定: 2%戊二醛 2h 1%锇酸 12h 3. 脱水：逐级丙酮，环氧丙烷 4. 干燥：临界点干燥，醋酸异戊酯 5. 喷金： 6. 扫描电镜观察,七、定量病理学技术, 体视学 (Stereology)： 二维结构信息定量推论三维结构信息 研究内容： 二维定量推论三维的原理、方法及应用，图像分析原理和方法 生物体视学 (Biological Stereology) 用体视学原理和方法研究生物组织的三维结构，并据生物组织的结构特点研究相应的体视学测试方法称为生物体视学,形态测量学（Morphometry） 平面测量学（Planimetry） 体视学(Stereology) 形态结构要素计数，如核分裂计数 显微分光光度术 流式细胞术 激光共聚焦显微图像分析 图像分析,特 点,给出量化结果 提高结果表达的客观性和准确性,应 用, 诊断 预后分析 基础数据 三维结构定量分析 形态与机能有机结合,八、分子病理学技术, 广义概念： 狭义概念：将分子生物学方法与病理形态学技术相结合，从分子生物学水平原位阐明病变的特点和规律谓分子病理学技术。 原位PCR技术 原位杂交技术 显微切割技术,九、其他病理学技术, 细胞及组织培养技术 细胞及细胞器分离技术 显微切割技术 显微摄影技术 核仁组成区技术 荧光染色技术 核移植技术 酶组织化学技术 放射自显影技术 流式细胞技术 激光共聚焦扫描显微镜技术,附: 常规病理学技术详解,一、标本的来源与收集 (一) 1、临床活检 2、尸体解剖 3、实验动物 （二） 1、检查申请单的姓名，标本的件数是否与之相符合。 2、标本是否符合要求。,二、标本的处理 1、对送检物进行编号登记，以免混乱。 2、小组织全部包埋。 3、大块组织切取其中部分组织，如肿瘤和肿瘤边缘组织，剩余组织在病理报告发出后约一个星期后处理。,三、组织的固定 将取好的组织放入固定液进行固定，活检组织的固定，由于受到时间的限制，不能过多的占用时间，最多只能占2小时，其它的组织可固定10-20小时，但最好不要超过24小时，因这个时间对以后的免疫组化的显示都有影响。,四、固定的作用 固定的作用不仅是使细胞内蛋白质凝固，终止或减少外源性酶和内源性酶的反应，防止细胞自溶，以保持组织的固有形态和结构，更重要的是保存组织或细胞的抗原性，不但使抗原不致失活，还要使抗原不发生弥散，以免在免疫组化染色时产生过深的背景。,五、固定的目的 1、能防止细菌的腐蚀和抑制组织的自溶 2、能凝固或沉淀细胞内或组织液的蛋白等 3、使组织硬化，便于切块 4、对某些具有传染性的标本，能防止其扩散 5、保存组织细胞中固有的物质 6、保存好大体标本 7、可增强染色,六、固定时的注意事项 1、组织块越新鲜越好 2、组织块不宜过厚过大 3、根据需要选择适当的固定液 4、组织固定时间不宜过长，也不能太短 5、固定液的量要充分，1：5 6、不应强行将组织装入较小的容器内 7、特殊方法需要特殊的固定液,七、固定液的选择 1、尽量选择对组织收缩少，渗透快的固定液 2、选择较通用的固定液，既能做好HE的染色，又能做免疫组化标记 3、特殊的病例选择特殊的固定液 如： 狂犬病丙酮 磷酸酶丙酮 糖原无水酒精,八、固定液的分类 .醛类：甲醛、戊二醛、多聚乙醛、丙稀醛等 .氧化剂类：四氧化饿（奥酸）、高锰酸钾、重鉻酸钾等 .蛋白变性类：醋酸、甲醇、乙醇等 .其它：氯化汞，苦味酸等。,九、固定液的使用 （一）甲醛（formaldehyde） 一般市售的含37-40%，平时使用都把它看为100%。它由甲醛气体饱和于水而成。比重为1.12，有一股刺鼻的气味。甲醛与组织蛋白质类的反应是多样而复杂的，因为它能和多种不同的功能基团结合。如近来的抗原修复就是认为组织中的蛋白与醛产生交联蛋白后，要将它们显示出来，就必须应用温度高达92以上的抗原修复液，才能将其交联的醛键打开，与后来的抗体结合，将其表达出来。,甲醛的优点： 1、收缩较小 2、固定较为均匀，穿透力强 3、能使组织硬化并富有弹性 4、能保存脂肪及脂类物质 5、成本较低,甲醛的缺点： 1、成分不纯，含少量的甲醇，影响酶反应 2、含少量的甲酸，易产生色素 3、不能固定尿酸和糖类物质 4、易挥发、污染环境 5、易产生醛基、封闭抗原,应用甲醛配成的固定液有： 1、缓冲福尔马林固定液（neutral buffered formaaldehyde） NaH2PO4H2O 4g Na2HPO4（无水） 65g 蒸馏水 900ml 甲醛 100ml,2、10%福尔马林固定液 甲醛 10ml 自来水 90ml 3、10%福尔马林盐固定液 甲醛 10ml 自来水 90ml NaCl 0.9g,4、Bouin氏固定液 苦味酸饱和水溶液 75ml 甲醛 25ml 冰醋酸 5ml,5、Zonker氏液 氯化汞 5g 重铬酸钾 2.5g 硫酸钠 1g 水 100ml 注：该固定液固定时间为16-24h，染色前应用碘酒除去汞盐的沉淀，否则会影响染色后切片的观察。,（二）酒精（alcohol） 有无水酒精（99.8%）和工业酒精（95%）在病理技术方面，酒精是一种重要的试剂，它可配成不同的浓度来进行脱水，如：60%、70%、80%、90%、95%等，在切片染色前，用酒精来除去二甲苯，在染完色后则用其来脱水。,应当注意的是，组织脱水时应根据组织的大小、器官或部位、取材的大小来确定脱水时间，一般认为浓度越低，脱水时间可以相对延长，如70%可用来长期保存标本，但如果在100%的酒精里时间就不能太长，否则组织易脆不利于切片。酒精可以与其它试剂混合，配成混合固定液，如AAF固定液。,酒精的优点： 1、可以保存糖原和尿酸结晶。 2、能在任何比例的情况下与水混合。 3、能溶解苯类物质，为染色法中的桥梁试剂。 4、能脱去切片上的水份。 5、可配成混合固定液。 6 、可作为保存标本的固定液。 7 、可用来消毒。,洒精的缺点： 1、可溶解脂类及脂肪物质。 2、可沉淀白蛋白，球和核蛋白。 3、渗透力不强。 4、可脱去某些已着染切片的颜色。 5、不作为单独的固定液。 6、价格昂贵。,病理组织切片的制作,一、石蜡切片 （一）组织脱水 人体或各种动物的各种组织，都含有大量的水分。在石蜡切片中，水与蜡不能相混合，必须想办法将含于组织中的水分脱去，才能完成一系列的操作过程，制作好的切片。,1、人工脱水法优点： （1）可根椐不同的组织选择最佳时间。 （2）可避免细小的组织经受不必要的脱水时间,防止组织的硬脆 （）可灵活掌握，随时进行观察和调整,2、人工脱水法的不是之处： （1）需耗人力； （2）必须在白天完成，晚上无法进行换液； （3）如机器发生故障，组织块被搁置在外边，致使组织干涸，影响了制片的质量。,人工脱水程序 (适应于3mm厚的组织块),1、80%酒精 24h 2、90%酒精 12h 3、95%酒精 4h 4、95%酒精 4h 5、100%酒精 2h 6、100%酒精 2h,7、二甲苯 40min 8、二甲苯 40min 9、石蜡（软） 1h 10、石蜡 1h 11、石蜡 1h,细小组织脱水程序 （适合于胃、肠镜活检，肝、肺、肾穿刺活检的组织） 1、80%酒精10-15min 2、90%酒精10-15min 3、95%酒精10-15min 4、100%酒精10-15min 5、二甲苯5-10min 6、石蜡15-20min,Shandan全封闭电脑控制全自动组织脱水机 该机由电脑、反应缸和试剂储存缸三部分构成。 电脑屏幕可显示时间、温度、所需时间、是否用真空负压等，可根据不同的时间要求，编制9套不同的组织脱水程序。,1、正常室温脱水程序 A、10%福尔马林 2h B、90%酒精 1.5h C、95%酒精 1.5h D、95%酒精 1h E、95%酒精 1h F、100%酒精 1h,G、100%酒精1h H、100%酒精1h I、二甲苯40min J、二甲苯40min K、石蜡65真空负压1h L、石蜡65真空负压1h,2、加温脱水程序 应用正常室温的脱水时间，再编入加温程序，加温的温度一般在37-40 3、真空负压脱水程序 应用正常室温的脱水时间，再编入真空负压脱水程序,4、周末程序,A、10%福尔马林10h B、90%酒精10h C、95%酒精10h D、95%酒精10h E、95%酒精10h F、100%酒精2h,G、100%酒精2h H、100%酒精2h I、二甲苯1h J、二甲苯1h K、石蜡65真空负压1h L、石蜡65真空负压1h,该机的特点： 1、容量大，一次可处理250-300个包埋盒。 2、全部密闭，试剂不易挥发，保护了环境。 3、带有定期的搅动装置，使组织固定均匀，脱水彻底，浸蜡充分。 4、脱水过程可使用真空负压和加热。 5、该机占地量小。,组织透明 应用于透明组织的试剂有很多种，有：二甲苯，三氯甲烷（氯仿），香柏油，苯酚，松节油等。,二甲苯的主要性能和使用 它是一种透明无色的液体，挥发性强，打开后即可闻到它的味道。它可溶于洒精，丙酮等含醇类的物质，也可溶解石蜡，但不溶于水。当脱完水的组织放入二甲苯后，经过一定的时间组织即可透明，如果组织四周透明，中间留有白点，则说明中间部分没有彻底脱水，此时应将组织重新放回洒精脱水。但经这样处理后的组织切片效果较差。,（二）组织浸蜡 将透明的组织移放入65左右的电热恒温箱或脱水机上的特设蜡缸中，浸渍一定的时间，这个过程称为浸蜡。,1、可起到填充、支撑的作用。 组织经酒精、二甲苯的作用后，其中有许多物质被溶解去，如脂肪及脂类物质、糖原等。因而遗留下许多腔隙，妨碍了切片。在切片时由于诱导剂的作用下石蜡可以浸入到物质的各个角落，当石蜡冷却时，浸入到各处的石蜡就填充在各处的空隙，包括血管和器官等。使组织保持原有的形状，也使包埋后蜡块保持平整，便于切片。,2、使切片能完整的切除并保持切片的美观 3、石蜡的使用 （1）石蜡的性质 它是一种碳氢化合物，熔点45-70以上。,（2）石蜡熔点的种类 45 52-54 54-56 56-58 58-60 60-62,（3）石蜡性质的改善 增加石蜡的硬度，如加入脂蜡酸、柏油、杨梅蜡等。 增加石蜡的粘度，如加入蜂蜡、硬脂肪等。 加热促进石蜡性质的改善 熔化冷却熔化,4、浸蜡的方法 传统浸蜡法 将透明好的组织放入熔化的石蜡中浸渍一定的时间。 真空负压浸蜡法 将透明好的组织放入浸蜡缸中，然后移入真空负压箱内，或者脱水机自身配有的真空负压装置进行浸蜡。 浸蜡时间，真空负压数见表。,真空负压浸蜡时间压力表,注：1、计时应以石蜡全部溶化时计起。 2、当抽气时，温度应调高几度，至抽气完成后才调至所需温度。,（四）组织包埋 将浸完蜡的组织埋葳于石蜡中的过程称为组织包埋。 包埋时的注意事项： 1、所使用的镊子，包埋框，最好放于37的恒温箱内，以免这些物质过冷（在冬天时）而过早冷却包埋的石蜡，影响包埋的质量，这种现象在没有石蜡包埋机的单位较为明显。,2、打开脱水盒，取出组织块，将一平整的大的一面朝下，并用镊子压平，使其保持在一水平面上。 3、每包埋完一块，应附上标签，以免出差错或张冠李戴。如为塑料包埋盒，则可少去这一步，极为方便。 4、对于管腔的组织如血管、肠、气管等应竖起来包埋对于皮肤及胃、肠、等组织应辩认好方向。仔细包埋。,5、细小多块的组织，可包埋在一个蜡块，但应保持在同一平面上，以免影响切片。 6、包埋完后，蜡面凝固，便可放入水中加速硬化，如带有冷冻设备的包埋机，则可少去这一步。,7、包埋时组织块不能使其冷却凝固，应保持组织块上的蜡处于熔化状态，这样包埋时才能和包埋蜡溶为一体。如果组织块自身的蜡先凝固，包埋后的蜡块切片时组织与边蜡分离切不成佳片严重的会崩掉，影响切片。,（五）修切蜡块 应用包埋框包埋的组织块，切片前一定要将其切好，组织块与边蜡应保持有0.5cm的厚度，才有利于切片。 1、有利于切片，使切片能连续切出。 2、减少损伤刀口延长刀口的寿命，以利多切蜡块。 3、有利于切片的裱贴。例如一张载片要裱两块组织时，修切好的蜡块，就能使它们摆得整齐。,（六）切片和裱片 在操作时的注意事项： 1、持蜡器一定要将蜡块挟紧挟牢，以免使其跳动而影响切片。 2、刀一定要保持无口、锋利，一次性刀片做到这一点较容易，大刀片要做到上述要求就比较困难。因此就要认真地磨好刀才能保证切片的质量。,3、裱片的水温不能过高或偏低，高者可溶化所切出的切片，低者则展不开切片，使切片留有皱纹，最适的水温应是比石蜡的溶点低2-5，如石蜡的溶点为60-62，裱片的水温则可达55-57，余者类推。 4、对于细小的组织，应特别小心修切，防止一刀切下，全部皆休的情况。,5、对于多块细小的组织，原则上是每一细小的组织都应有一个切面。修切的时候更应特别小心。 6、每切完一块，裱于载片后应随时刻上编号，以防止差错或混乱的现象发生，减少差错的苗头。 7、挑切片的毛笔，应选用细小柔软的毛笔为佳，用时向上挑，决不能往下，以免刀口伤及毛笔。,石蜡切片常可出现的问题 1、石蜡切片不能形成带状的原因是室温低，蜡块周边不整齐。 2、石蜡切片，切片卷起的原因是刀的倾斜角度过大或刀不快。 3、石蜡切片出现的皱折的原因是石蜡溶点低，纯度不足。 4、石蜡切片出现厚薄不均匀的主要原因是组织块挟不牢固或组织坚硬如肌瘤等。,5、石蜡切片出现波浪状的原因是组织块太硬或骨组织末完全脱钙。 6、石蜡切片，当切片放入水中裱片时，切片周围的蜡迅即向四边散开，其主要原因是组织脱水不彻底，浸蜡浸不进去。包埋蜡中含有二甲苯。 7、石蜡切片，当切片切出后蜡块向上时，把已切出的切片带走并损坏的原因是切片刀背面留有残余石蜡。,8、组织切片常见的人为性色素沉着物是福尔马林色素，常见的器官是肝、脾。 9、组织切片常见的外源性色素是碳末，常见的器官是肺。 10、石蜡切片时切片刀的最宜角度是 5-30 11、一般所称呼的标准室温是20 12、组织浸蜡的温度最好为 12、石蜡溶点的最高度高2-3即65。,（七）石蜡切片的烘烤 石蜡切片在染色前，为了防止脱落，都必须进行烘烤，以促进切片附贴的牢固性。 1、常规切片烘烤 常规石蜡切片切完后，在60的烤箱中烘烤20-30min便可进行染色。,2、免疫组化切片的烘烤 应用于免疫组化染色的切片，由于整个过程都在冲冲洗洗中进行，因此要求切片附贴要十分牢固，以免脱片，烘烤切片的时间可为1h、1.5h、2h、3h等，均在60的烤箱中烘烤。,病理切片常规染色,一、染色的目的 病理学的各种切片，都必须应用一种以上的染料通过不同的方法将切片的各种不同的组织结构给予显示出来，以利于镜下辨别其各种不同的形态，做出正确的诊断。,二、染色的作用 1、化学作用： 染液中的阴阳离子与组织中的阴阳离子相互作用所完成的染色。染液中有酸性和碱性染料之分，酸性染料有染色作用的部分是阴离子，而碱性染料有染色作用的部分则是阳离子。组织的各种细胞中细胞核为酸性，它可与苏木素液中的阳离子发生反应。细胞桨中的阳离子则与伊红液中的阴离子发生反应，完成染色。,2、物理作用： 染料通过浸透，分散浸入到组织的间隙中，因受分子的引力作用，染液中的色素粒子被吸附而完成染色过程。 3、染色方法 应用于常规病理切片的染色方法称为普通染色法或HE染色法，而用特别的染色法则称为特殊染色法。,HE染色法程序,结果：细胞核：蓝色，软骨基质钙盐等深蓝色；细胞浆深浅不同的粉红色，嗜酸性颗粒鲜红色；胶原纤维呈粉红色，肌纤维呈鲜红色，弹力纤维呈亮红色，红血球为桔红色，蛋白基质为粉红色。,染色时的注意事项 （1）切片烘烤以切片附贴牢固为原则，否则容易掉片。 （2）切片脱蜡一定要彻底，不然会导致染色深浅不一。 （3）切片染苏木素前可令其无水化，这样可延长苏木素的寿命。因为每次染色前，切片水洗，然后进入染液虽然每次带入的水分很少，但随着次数的增加，所带入的水分足可以稀释染液影响染色的质量。,（4）切片在苏木素的染色时间应充分宁过勿不足。对于初学者来说更应过染，否则分化会过度导致染色过浅。 （5）切片分化时，要根椐不同的组织来确定分化时间，并不断积累经验。 （6）伊红染色时间也要充分，经低浓度洒精时应仔细观察，必要时快速通过，以免过于褪色。,（7）切片致无水酒精后，不要在控干无水酒精时让切片干涸，可以不经控干直接地进入碳酸二甲苯（也可以进入二甲苯酒精混合1：1）碳酸有较强的吸水性透明也好很适合南方地区。 （8）切片从二甲苯中取出封固时，切不能让其干涸，因南方地区空气潮湿干涸的切片与空气接触，可吸收其水份。这样的切片很容易裉色。切片不干涸，表面被着二甲苯，由于它不溶于水起到与水隔绝的作用。,（9）滴中性树胶封盖切片，胶不能太浓，太浓胶难以均匀铺开，且易产生气泡，又不能太稀过稀的胶由于二甲苯含量较多，当切片干燥时，二甲苯挥发掉，胶封的切片收缩，即可导致一半切片没有被胶封固的结果。最合适的胶应是滴下成珠。,（10）封固切片时，盛胶的瓶子及瓶盖四周不要留有余胶，否则瓶盖难以打开。因此每次用完后都必须将其擦干净。当打不开瓶盖时应放入烤箱中烘烤，即可打开。 （11）标签附贴要认真，不要贴得歪歪斜斜，影响切片的外观.,染液的配制 (一）苏木素的配制 1、苏木素的种类： A、明矾苏木素（Harris,Mayer, Ehrlich） B、铁苏木素（Wiegert,Heidnhain） C、钨苏木素（PTAH） D、铅苏木素（Soecia）,（1）Harris苏木素的配制（Harris.l900） 苏木素 0.5g 无水乙醇 5ml 钾明矾（硫酸铝钾） 10g 蒸馏水 100ml 氧化汞 0.25g 冰醋酸 4ml,预先把苏木素溶于无水酒精中配制时，取一三角瓶倒入蒸镏水，再加入钾明矾，于电炉上加热至90左右时，拔去电源加入酒精苏木素，再插上电源继续加热，持续35分钟，拔去电源，加入氧化汞，此时可产生大量的气泡，应防止其溢出瓶外。再继续通电加热，煮沸后持续35分钟，此时溶液表面看呈深紫黑色，即可撤离电源，用备好的冰凉水，将烧瓶迅速的插入水中，让染液迅速冷却，中止氧化放入暗处。于第二天过滤后再加入冰醋酸，即可使用，染色时间515分钟。,（2）Mayer氏苏木素（Mayer,1903） 苏木素 0.1g 蒸镏水 100ml 钾明矾 5g 柠檬酸 0.1g 水合醛 5g 碘酸钠 20mg,将蒸包馏水稍为加温，加入苏木素不停地搅拌直至溶解，再加入钾明矾，令其溶解后再加入碘酸钠过滤后即可使用，染色时间1020分钟，如果先用天表蓝为媒染剂，染色时可在23分钟。,配制苏木素的注意事项 1、苏木素可以配成5%或10%，让其氧化产生苏木红，然后根椐每次配制溶液的量，再决定加入多少。 2、在配制苏木素时，三角烧瓶的选择也很重要，例如，配制500ml 的溶液，应选用15002000ml的三角烧瓶，配制1000ml则可选3000ml的烧瓶，这样溶液在加入氧化汞时，才不会喷出瓶外。,3、冰醋酸一定要在溶液过滤后加入如果过滤前加入，则在过滤时溶液很难通过滤纸，这主要是冰醋酸草可造成对滤纸的损害。,(二）伊红的配制 1、1%伊红洒精的配制 伊红（水溶） 5g 70%-75%酒精 500ml 取少许蒸馏水来溶解伊红或称曙红，当完全溶解后，再加入酒精，然后再加入少许冰醋酸，此时溶液即可变为鲜红色。 注意：冰醋酸一定要加进去如果没有加入冰醋酸，细胞浆将难以染得鲜艳。,1、切片机的使用，应如何注意保养？ 切片机座应注意平稳，切片时应注意摇转速度的快慢要尽量保持均匀一致。滑动面要经常滴上机油，以利于滑动及旋转自如和防锈，切片完后除去残蜡，取下切片刀，先用湿布擦去余蜡，继用干布擦干，再用油布擦一遍，最后用罩盖好切片机，以防灰尘落于机上，影响机器的运转。,2、化学试剂使用时的注意事项 （1）已打开的药品或染色时的玻璃瓶染色液，每次用后即随手盖紧，以免挥发，易挥发易吸潮的药品用后蜡封。 （2）易燃的试剂要远离火种，谨防火灾，因病理科有较多的易燃化学试剂。,（3）强酸，强碱试剂或有腐蚀性的废染液，不要直接倒入下水道，以免腐蚀下水道，造成下必要的损失。 （4）易变质或易氧化失效的试剂，应标明配制日期，妥为保存，有的只能一次性用完，因此,应本着节约的原则，用多少，配多少，切勿造成浪费。,3、石蜡切片刀应怎样保养好？ 切片刀要经常磨，保持锋利无刀口，每次用完后用布擦干净，再用油布擦，以防刀口生锈影响切片。 4、如何使树胶处于中性状态？ 取少量无水碳酸钠，加入到封固用的树胶中搅拌后放置数日取其上清液，即为中性树胶。,5、切片染完苏木素后的分化，应该如何控制和注意什么问题？ （1）分化液中盐酸不能高于1%，否则会因分化过强而将已着色的颜色大部分脱水，造成染色过浅。 （2）对各种组织应视情况而定，如淋巴结的切片，应分化较长时间等。 （3）分化完后，应在显微镜下观察，如发现核中的物质不清楚，则应继续分化至清晰为止。 （4）要认真操作，细心观察，不断总结。,6、切片欠佳表现在哪些方面？ 7、切片欠佳的主要表现有：切片见有刀痕皱折、横裂、折叠、不全、破碎、组织松散。厚薄不匀或呈波浪状等现象。,冰冻切片,一、种类： 1、低温恒冷箱切片法 2、二氧化碳冰冻切片法 3、甲醇循环制冷冰冻切片法 4、半导体冰冻切片法 5、氯乙烷冰冻切片法,二、冰冻切片的目的 1、在手术进行中。突然发现病人的病变与原诊断不相符合或者怀疑时需要病理给予确定。 2、了解淋巴结内是否有转移的肿瘤细胞或者转移的程度，以利于确定以后的治疗措施。,3、对于已确定恶性肿瘤的病人则需要了解其手术范围是否足够，上下切缘是否有残存的肿瘤细胞。 4、在剖腹探查所发现的肿块。 5、显示组织中的脂肪类物质。 6、某些酶的显示如ATP酶琥珀酸脱氢酶等。 7、神经病理学中的某些染色法。 8、对某些物质所进行的免疫荧光的研究。,三、冰冻切片的操作 （1）本室现有Shandon-AS620E型冷冻切片机的主要性能。左边的切片台可达到-60左右，冷冻箱内在0-30间可任意调节，箱面上有电子控制板，装有急速冷冻，即放上标本启动该键机器马上进行冷冻工作并持续10分钟；有冷冻台温度显示冷冻箱内温度显示；有即时除霜内温度显示；,有即时除霜键，启动该键机器可持续工作15分钟，将工作间顶部后面的制冷栅上的霜除掉；有照明键，启动该键可照明工作间；有消毒键当进行一星期的工作后，启动该键可对工作间进行消毒；有工作间面的密锁键启动键可将工作间锁住，除此之外该机的左边有四个按键两个为快速自动进退、两个为微小进退、另有一个手动旋钮，调节修块时的进退。,（2）切片取末经固定的组织不能太大太厚，厚者冰冻费时，大者难以切完整。最好2424 4mm。 （3）取出组织支承器，放平摆好组织周边滴上包埋剂，速放入冷冻台上冰冻，小组织应先取一组织支承器滴上包埋剂让其冻成一个小台再放上细小组织，滴上包埋剂。 （4）将冷冻好的组织块夹紧于切片机上修平切面。,（5）调好厚度，根椐不同的组织而定，一般在5-10um. （6）调好防卷板，制作冰冻切片的调节，关建在于防卷板的调节，这就要求要细心，准确，将其调校，调校至适当的位置，此时切片。冰冻切片在第一时间顺利地在刀与防卷板之间通过，平整地躺在持刀器的铁板上。这时便可掀起防卷板，取一载片，将其附贴上即可。,（7）用于附贴切片的载片，不能存放入冷冻的地方，于室温存放即可。因为当附贴切片时，从室温中取出的温差，当温度较高的载片附贴上温度低的切片时，由于两种物质温度的差别，当它们碰撞在一起时，分子间的彼此转移而产生了一种吸附力。使切片与载片牢固地附贴在一起。如果用冷藏的载片附贴切片，就没有这种现象发生。,（8）应视不同的组织选择不同冰冻度。冷冻箱中冷冻度的高低，主要根椐不同的组织而定，不能一概而论，例如：切未经固定的脑组织，肝脏组织和淋巴结组织等，冷冻箱的温度可调在-10-15左右。切甲状腺，脾、肾、肌肉等组织,则应调在-15 -20左右。切带有脂肪的组织如乳腺组织，应调在-25左右，如为大量的脂肪组织时，应调至-30。,四、冰冻切片时的注意事项 1、防卷板和切片及持刀架上的地方应保持干净经常用毛笔挑除切片残余及用柔软的纸张擦。因为包埋剂常常贴在上述的地方。如果不把它们去除掉，就会影响切片。使切片不能完整切出。 2、应用于冰冻切片的组织不能过大过厚，过大难以切出好片过厚冰冻费时，最好的取材应在24 24 2cm。,3、冰冻组织前组织放于组织支承器上应视组织的走势来给予放置，然后四周加上包埋剂，保持周边的整齐，如出现凹凸不平的地方，可用刀子将其修平，才不致于影响切片。,4、组织块不须经各种固定液固定，尤其是含水的固定液在未能达到固定前更不能使用。临床快速冰冻切片不须要预先固定，一是为了争取时间，二是固定了的组织反而增加了切片的难度。如果使用了未完全固定的组织做冰冻切片，就会出现冰晶，这是因为含水溶液的固定液在组织未经固定前，其中的水份也会渗入到组织当中去，当冰冻发生时，这些水份就存留于组织中形成了冰晶。,5、当切片时，如果发现组织冰冻过度时，可将冰冻的组织取出来，于室温中停留片刻，以利于软化组织，使其不致于过度冰冻。,五、冰冻切片的快速染色 1、用普通染色进行染色（HE染色） （1）固定、切片用电吹风吹干后于10%的福尔马林盐或纯丙酮中固定2分钟后自来水冲洗。 （2）滴少许苏木素染液于切片上于酒精灯上加热染色，当见有蒸汽时即可中止染色，快速水洗、分化、用热水促其蓝化、伊红对比染色、酒精脱水、二甲苯透明、中性树胶封固。,2、超声波快速染色法 （1）固定：切片的固定与上同。 （2）把水洗后的切片插入装有苏木素的玻璃瓶中超声波处理30sec或1min,水洗、分化、放于装有热水的玻璃瓶中、超声波处理30sec,酒精脱水，二甲苯透明封固。,结果：经上述各种方法处理后所制作的切片。细胞核呈蓝色，软骨基质钙盐深蓝色，胞浆呈深度不同的粉红色，嗜酸性颗粒为鲜红色，胶原纤维量粉红色，肌纤维呈鲜红色，弹力纤维呈亮红色，切片完整，未见有冰晶出现。,