全身用药的毒性评价

全身用药的毒性评价全身用药的毒性评价 杨杨 斌斌 2012.05.052012.05.05 新药评价的核心新药评价的核心 安全安全有效有效质量可控质量可控毒毒 理理 学学药药 理理 学学 药药 学学 -致癌性致癌性 遗传毒性遗传毒性 生殖毒性生殖毒性 局部耐受性、过敏、局部耐受性、过敏、依赖性、免疫毒性依赖性、免疫毒性 光敏和其它试验等光敏和其它试验等 了解毒性反应剂量、时间、强度、症状、靶器官及可逆性等，了解毒性反应剂量、时间、强度、症状、靶器官及可逆性等，为临床方案提供参考、预测出现的毒性反应，制订临床防护为临床方案提供参考、预测出现的毒性反应，制订临床防护 措施、保证受试者用药安全措施、保证受试者用药安全 毒理学毒理学局部用药毒性局部用药毒性全身用药毒性全身用药毒性急性毒性急性毒性长期毒性长期毒性特殊毒性特殊毒性目目的的全身用药毒性全身用药毒性概念：概念：指药物经过不同给药途径吸收入血后指药物经过不同给药途径吸收入血后 所引起全身各组织和器官的毒性反应所引起全身各组织和器官的毒性反应意义：意义：是药物非临床安全评价的最基本内容是药物非临床安全评价的最基本内容内容：内容：包括急性毒性评价、长期毒性评价和包括急性毒性评价、长期毒性评价和 其他其他第一节第一节 急性毒性评价急性毒性评价 急性毒性试验急性毒性试验（acute toxicity test）又称单次又称单次给药毒性试验给药毒性试验,是研究是研究动物动物一次或一次或24小时内小时内多次多次给予受试物后，给予受试物后，一定时间（一定时间（14天）天）内试验动物所内试验动物所产生的毒性反应产生的毒性反应(死亡或明显毒性死亡或明显毒性)。一、一、概述概述获取新药毒性反应信息：获取新药毒性反应信息：通过观察急性中毒症状，通过观察急性中毒症状，对阐明药物的毒性作用对阐明药物的毒性作用（大小和性质）（大小和性质）和了解其毒性和了解其毒性靶器官具有重要意义。靶器官具有重要意义。为长期毒性和特殊毒性试验的剂量设置提供依为长期毒性和特殊毒性试验的剂量设置提供依据：据：所获得的信息对长期毒性试验的剂量设置和某些所获得的信息对长期毒性试验的剂量设置和某些药物药物期临床试验起始剂量的选择具有重要参考价值，期临床试验起始剂量的选择具有重要参考价值，也能提供一些与人类药物过量急性中毒相关的信息。也能提供一些与人类药物过量急性中毒相关的信息。目的和意义目的和意义应遵循应遵循“具体问题具体分析具体问题具体分析”的原则的原则 二、基本内容二、基本内容 动物动物 1.动物合格（要求？）动物合格（要求？）2.至少两种哺乳动物，啮齿和非啮齿类动物各一种至少两种哺乳动物，啮齿和非啮齿类动物各一种 3.受试药物为儿童拟用药必要时应采用幼年动物受试药物为儿童拟用药必要时应采用幼年动物 4.雌雄各半，受试药物为拟单一性别药物则需要选雌雄各半，受试药物为拟单一性别药物则需要选 用用单一性别动物单一性别动物 5.动物初始体重不应偏差平均体重超动物初始体重不应偏差平均体重超20%（一）实验动物的选择和受试物（一）实验动物的选择和受试物上下颌只有上下颌只有1对对门齿门齿，喜啮咬较坚硬的物体，喜啮咬较坚硬的物体，门齿无根，能终生生长门齿无根，能终生生长。受试物受试物1.制备工艺稳定，符合临床试验用质量标准规定制备工艺稳定，符合临床试验用质量标准规定2.注明受试物名称、来源、批号、含量（规格）、注明受试物名称、来源、批号、含量（规格）、保存条件及配置方法，并附自检报告保存条件及配置方法，并附自检报告3.所用辅料、溶媒等应标明批号、规格和生产厂家，所用辅料、溶媒等应标明批号、规格和生产厂家，并符合试验要求。并符合试验要求。（一）实验动物的选择和受试物（一）实验动物的选择和受试物 剂量剂量 通常选择通常选择4个以上的剂量，希望其中至少个以上的剂量，希望其中至少3个个剂量组落在剂量组落在10%-90%的死亡范围之内的死亡范围之内。1.通过文献检索，为已知化学类别的药物确定预期通过文献检索，为已知化学类别的药物确定预期毒性中值毒性中值2.对于全新结构的药物或中草药复方，可先通过小对于全新结构的药物或中草药复方，可先通过小批量动物的摸索，找出批量动物的摸索，找出0%及及100%估计致死量估计致死量。（二）给药剂量水平、途径、容量（二）给药剂量水平、途径、容量 4-5个剂量组个剂量组，同时设空白和（或）溶媒，同时设空白和（或）溶媒（辅料）对照组（辅料）对照组 剂距以剂距以0.65-0.85为宜为宜 小鼠每组小鼠每组10只（雌雄各半），大鼠不应少只（雌雄各半），大鼠不应少6-8只只 限量限量 口服急性毒性是口服急性毒性是5g/kg,注射是注射是2g/kg（二）给药剂量水平、途径、容量（二）给药剂量水平、途径、容量途径途径 给药途径至少包括临床拟用途径和一种能使原型给药途径至少包括临床拟用途径和一种能使原型药物较完全进入循环系统的途径药物较完全进入循环系统的途径 口服给药前，为减少吸收差异和大容量给药造成口服给药前，为减少吸收差异和大容量给药造成胃急性扩张，小鼠和大鼠至少应停食胃急性扩张，小鼠和大鼠至少应停食4-6h，一般，一般要求一夜停食要求一夜停食(不停水，不停水，12)h，投药后再停食，投药后再停食3-4h。（二）给药剂量水平、途径、容量（二）给药剂量水平、途径、容量容量容量 各给药途径的容量一般为小鼠各给药途径的容量一般为小鼠0.40.5ml0.40.5ml20g(20g(体体重重)，大鼠，大鼠lmllmll00g(l00g(体重体重)。小鼠口服最大容量不超。小鼠口服最大容量不超过过0.8ml0.8ml20g(20g(体重体重)，其他途径不超过，其他途径不超过0.5ml0.5ml20g(20g(体重体重)。大鼠口服最大容量不超过。大鼠口服最大容量不超过2ml2mll00g(l00g(体体重重)，其他途径不超过，其他途径不超过lmllmll00g(l00g(体重体重)。（二）给药剂量水平、途径、容量（二）给药剂量水平、途径、容量观察时间观察时间 给药后几小时内应严密观察动物反应，以给药后几小时内应严密观察动物反应，以后每天上下午各观察一次后每天上下午各观察一次 急性毒性试验必须观察急性毒性试验必须观察7-14天，一般不超天，一般不超过两周过两周（三）观察时间及指标（三）观察时间及指标观察指标观察指标给药前后应观察体重、进食、进水的状况，密切观给药前后应观察体重、进食、进水的状况，密切观察异常毒性症状包括察异常毒性症状包括行动：不安定、多动、发行动：不安定、多动、发声；声；神经系统反应：举尾、振颤、痉挛、运动失神经系统反应：举尾、振颤、痉挛、运动失调、姿态异常；调、姿态异常；自主神经系统反应：眼球突出、自主神经系统反应：眼球突出、流涎、流泪、排尿、下泻、竖毛、皮肤变色、呼流涎、流泪、排尿、下泻、竖毛、皮肤变色、呼吸；吸；死亡。死亡。（三）观察时间及指标（三）观察时间及指标应每日记录体重、毒性反应和死亡情况，濒死应每日记录体重、毒性反应和死亡情况，濒死动物应单独饲养，死后及时解削进行肉眼观察动物应单独饲养，死后及时解削进行肉眼观察和病理组织学观察。试验结束存活动物也进行和病理组织学观察。试验结束存活动物也进行解剖，如有病变进行组织学观察解剖，如有病变进行组织学观察。（四）结果处理和分析评价（四）结果处理和分析评价 二、急性毒性试验常用试验方法二、急性毒性试验常用试验方法 最大给药量法最大给药量法 近似致死计量法近似致死计量法 固定剂量法固定剂量法 半数致死量法半数致死量法 上下法上下法 累积剂量设计法累积剂量设计法对于某些低毒的受试物可采用该方法。在合理的最对于某些低毒的受试物可采用该方法。在合理的最大给药浓度及给药容量的前提下，以允许的最大剂大给药浓度及给药容量的前提下，以允许的最大剂量单次给药或量单次给药或24小时内多次给药小时内多次给药(剂量一般不超过剂量一般不超过5g/kg体重体重)，观察动物出现的反应。一般使用，观察动物出现的反应。一般使用10-20只动物，连续观察只动物，连续观察14天。天。结果判断：结果判断：1）无死亡。）无死亡。MLD限度剂量；限度剂量；2）死亡率）死亡率限度剂量；限度剂量；3）死亡率）死亡率50%，重新设，重新设计计。（一）最大给药量试验（一）最大给药量试验以小鼠口服为例：以小鼠口服为例：动物数不得少于动物数不得少于10只，雌雄各半，容量一次不只，雌雄各半，容量一次不超过超过0.4ml/10g(体重体重)，多次给药间隔时间不，多次给药间隔时间不低于低于4h，观察，观察14日，记录毒性反应和体重变化。日，记录毒性反应和体重变化。如仍未见毒性反应或体重正常增加，则可认为如仍未见毒性反应或体重正常增加，则可认为该药物小鼠最大给药量未见毒性反应，或该药物小鼠最大给药量未见毒性反应，或LD50大于最大给药量。大于最大给药量。（一）最大给药量试验（一）最大给药量试验1.根据小动物的毒性试验结果、受试物的化学结构和其根据小动物的毒性试验结果、受试物的化学结构和其它有关资料，估计可能引起毒性和死亡的剂量范围。它有关资料，估计可能引起毒性和死亡的剂量范围。2.按按50%递增法，设计出含数个剂量的剂量序列表。递增法，设计出含数个剂量的剂量序列表。3.根据估计，由剂量序列表中找出可能的致死剂量范围，根据估计，由剂量序列表中找出可能的致死剂量范围，在此范围内，每间隔一个剂量给一只动物，测出最低在此范围内，每间隔一个剂量给一只动物，测出最低致死剂量和最高非致死剂量致死剂量和最高非致死剂量，4.用二者之间的剂量给一只动物。如果该剂量下动物未用二者之间的剂量给一只动物。如果该剂量下动物未发生死亡，则该剂量与最低致死剂量之间的范围为近发生死亡，则该剂量与最低致死剂量之间的范围为近似致死剂量范围；如果该剂量下动物死亡，则该剂量似致死剂量范围；如果该剂量下动物死亡，则该剂量与最高非致死剂量间的范围为近似致死剂量范围。与最高非致死剂量间的范围为近似致死剂量范围。（二）近似致死剂量法（二）近似致死剂量法（ALD）该方法主要用于非啮齿类的动物试验。该方法主要用于非啮齿类的动物试验。一般采用一般采用6只健康的只健康的Beagle犬或猴。犬或猴。犬的年龄一般为犬的年龄一般为4-6月龄，月龄，猴的年龄一般为猴的年龄一般为2-3岁，选用岁，选用其他动物时应说明理由。其他动物时应说明理由。试验选择试验选择5、50、500和和2000mg/kg四个固定剂量四个固定剂量进行试验，特殊情况下可增加进行试验，特殊情况下可增加5000 mg/kg剂量。剂量。实验动物首选大鼠，给药前禁食实验动物首选大鼠，给药前禁食6-12小时，给受小时，给受试物后再禁食试物后再禁食3-4小时。采用一次给药的方式进行。小时。采用一次给药的方式进行。如无资料证明雄性动物对受药试物更敏感，首先如无资料证明雄性动物对受药试物更敏感，首先用雌性动物进行预试。用雌性动物进行预试。（三）固定剂量法（三）固定剂量法（Fixed-dose procedure）根据受试物的有关资料，从上述四个剂量中选择根据受试物的有关资料，从上述四个剂量中选择一个作为初始剂量一个作为初始剂量 若无有关资料可作参考时，可用若无有关资料可作参考时，可用500mg/kg作为作为初始剂量进行预试，如无毒性反应，则用初始剂量进行预试，如无毒性反应，则用2000 mg/kg进行预试，此剂量如无死亡发生即可结束进行预试，此剂量如无死亡发生即可结束预试。预试。（三）固定剂量法（三）固定剂量法（Fixed-dose procedure）如初始剂量出现严重的毒性反应，即降低一个如初始剂量出现严重的毒性反应，即降低一个档次的剂量进行预试，如此时动物存活，就在档次的剂量进行预试，如此时动物存活，就在此两个固定剂量之间选择一个中间剂量试验。此两个固定剂量之间选择一个中间剂量试验。每个剂量给一只动物，预试一般不超过每个剂量给一只动物，预试一般不超过5只动物。只动物。每个剂量试验之间至少应间隔每个剂量试验之间至少应间隔24小时。给受试小时。给受试物后的观察期至少物后的观察期至少7天，如动物的毒性反应到第天，如动物的毒性反应到第7天仍然存在，尚应继续观察天仍然存在，尚应继续观察7天。天。（三）固定剂量法（三）固定剂量法（Fixed-dose procedure）在上述预试的基础上进行正式试验。每个剂量至在上述预试的基础上进行正式试验。每个剂量至少用少用10只动物，雌雄各半。根据预试的结果，在只动物，雌雄各半。根据预试的结果，在上述四种剂量中选择一个可能产生明显毒性但又上述四种剂量中选择一个可能产生明显毒性但又不引起死亡的剂量进行试验，如预试结果表明，不引起死亡的剂量进行试验，如预试结果表明，5.0mg/kg引起死亡，则降低一个剂量档次进行引起死亡，则降低一个剂量档次进行试验。试验。（三）固定剂量法（三）固定剂量法（Fixed-dose procedure）（三）固定剂量法（三）固定剂量法（Fixed-dose procedure）固定剂量法试验结果的评价固定剂量法试验结果的评价 剂量mg/kg试 验 结 果 存活数2000mg/kg用2000mg/kg试验2000用500mg/kg试验该化合物无严重急性中毒的危险性 预试验：目的是找出预试验：目的是找出0及及100估计致死量。估计致死量。设四组以上，每组设四组以上，每组3-4只，先用只，先用1：10的剂量比给药的剂量比给药(如如5mgkg、50mgkg、500mgkg、5000mgkg固定剂量固定剂量)。观察观察7日，记录死亡动物数。日，记录死亡动物数。然后在死亡数然后在死亡数44和和04两组之间按两组之间按1：2(如如50mg/kg、100mg/kg、200mgkg、400mgkg)以下的剂量比进行重复试以下的剂量比进行重复试验，以此测得近似的验，以此测得近似的0和和100死亡率。死亡率。（四）半数致死量法（四）半数致死量法 正式试验正式试验 在预试验在预试验Dn和和Dm剂量范围内按等比设三个以上剂量组。剂量范围内按等比设三个以上剂量组。其组间剂量的比值，一般在其组间剂量的比值，一般在1；0.6至至1：0.9范围内。范围内。购入动物试验前应驯化购入动物试验前应驯化1星期，随机或按体重分组，每组星期，随机或按体重分组，每组10只以上，雌雄各半，只以上，雌雄各半，分别编号，给药前应禁食分别编号，给药前应禁食(不禁水不禁水)过夜。过夜。各给药组和溶剂对照组按体重给药后，试验当日应多次观察，第二日至最后一日各给药组和溶剂对照组按体重给药后，试验当日应多次观察，第二日至最后一日应每日有二人以上同时观察应每日有二人以上同时观察1-2次并及时详细记录毒性反应症状，症状出现和消次并及时详细记录毒性反应症状，症状出现和消失的时间，死亡时间，失的时间，死亡时间，第十四日全部动物测量体重处死并剖检，肉眼观察病变情况。有毒性反应、体重第十四日全部动物测量体重处死并剖检，肉眼观察病变情况。有毒性反应、体重减轻或脏器有病变的动物应在剖检后立即进行主要脏器的病理组织学观察。减轻或脏器有病变的动物应在剖检后立即进行主要脏器的病理组织学观察。（四）半数致死量法（四）半数致死量法 LD50和最小致死量及其可信限的计算可采用和最小致死量及其可信限的计算可采用Bliss法法，改进寇氏法、点斜法、简化概率单位法或其他的计算改进寇氏法、点斜法、简化概率单位法或其他的计算方法。计算结果对比表明，不同的计算方法，结果间方法。计算结果对比表明，不同的计算方法，结果间一般无明显差异，而不同实验室对同一样品试验结果一般无明显差异，而不同实验室对同一样品试验结果却常见有显著差异。因此，采用较简单的计算方法完却常见有显著差异。因此，采用较简单的计算方法完全可以满足全可以满足LD50计算的准确性。计算的准确性。（四）半数致死量法（四）半数致死量法 LDLD5050的测定存在明显的不足的测定存在明显的不足 动物动物消耗量大，获得的消耗量大，获得的信息有限信息有限；影影响响 LDLD5050值的因素较多，不同实验室之间所值的因素较多，不同实验室之间所得的数据差别较大；得的数据差别较大；从安全性评价角度来讲，需要的不是精确的从安全性评价角度来讲，需要的不是精确的LDLD5050值，而是更多的毒性信息，如：更多关注值，而是更多的毒性信息，如：更多关注 的的是动物出现的毒性和剂量间的量效关系是动物出现的毒性和剂量间的量效关系。（四）半数致死量法（四）半数致死量法 第二节第二节 长期毒性评价长期毒性评价 长期毒性试验（长期毒性试验（long-term toxicity test）,是是试试验动物连续多日接触较大剂量的药物所引起的中验动物连续多日接触较大剂量的药物所引起的中毒效应，为观察这种中毒效应而设计的毒理学试毒效应，为观察这种中毒效应而设计的毒理学试验。验。一、一、概述概述 观察动物在给予超过临床剂量（数倍或数十倍）和用药周期观察动物在给予超过临床剂量（数倍或数十倍）和用药周期（3-4倍以上）的情况下所出现的毒性反应倍以上）的情况下所出现的毒性反应 设法发现引起毒性反应的剂量、剂量与毒性之间的关系、中毒设法发现引起毒性反应的剂量、剂量与毒性之间的关系、中毒表现和程度、主要毒性靶器官或组织及可逆程度等表现和程度、主要毒性靶器官或组织及可逆程度等 预测临床研究阶段可能的安全范围和毒性，预先制定防治措施预测临床研究阶段可能的安全范围和毒性，预先制定防治措施或避免某些有特殊疾病患者的使用，减少临床可能的风险或避免某些有特殊疾病患者的使用，减少临床可能的风险 为临床试验初始剂量和指标的选择等提供重要参数为临床试验初始剂量和指标的选择等提供重要参数 新药报批临床时重点评审项目之一新药报批临床时重点评审项目之一目的和意义目的和意义长毒与急毒试验的根本差异长毒与急毒试验的根本差异：给药的期限不同给药的期限不同 给药的剂量范围不同给药的剂量范围不同 观察的毒效应不同观察的毒效应不同长毒与急毒试验的根本差异长毒与急毒试验的根本差异：2.2.给药的剂量范围不同给药的剂量范围不同长毒试验给药剂量较急毒试验给药剂量小得多长毒试验给药剂量较急毒试验给药剂量小得多无毒范围无毒范围LDLD505015g/kg15g/kg蓄积作用（蓄积作用（accumulation actionaccumulation action）药物蓄积（药物蓄积（material accunulationmaterial accunulation）功能性蓄积（功能性蓄积（functional accunulationfunctional accunulation）长毒与急毒试验的根本差异长毒与急毒试验的根本差异：3.3.观察的毒效应不同观察的毒效应不同急毒：死亡急毒：死亡 质反应质反应长毒：体重长毒：体重 摄食量摄食量 血液学等血液学等 量反应量反应 量变到质变的过程量变到质变的过程组成长期毒性实验的三个主要部分是实验动物、组成长期毒性实验的三个主要部分是实验动物、受试药物和观察指标。长期毒性试验费时、费受试药物和观察指标。长期毒性试验费时、费力，故必须根据新药类别、受试物性质和用途、力，故必须根据新药类别、受试物性质和用途、疗程长短、急性毒性试验和长期毒性预试验结果疗程长短、急性毒性试验和长期毒性预试验结果等周密考虑，精心设计，以避免难以弥补的缺等周密考虑，精心设计，以避免难以弥补的缺失。失。二、基本内容二、基本内容总原则：二种动物、三个剂量总原则：二种动物、三个剂量高剂量组应能充分反映药物的毒性高剂量组应能充分反映药物的毒性低剂量组不出现毒性反应低剂量组不出现毒性反应同时设已知药物毒性对照组和（或）一溶剂同时设已知药物毒性对照组和（或）一溶剂（或赋形剂）对照组（或赋形剂）对照组数量数量 给药途径给药途径 观察指标观察指标一般原则和要求 1.种类及品系种类及品系 a.应尽可能首先考虑急毒试验已证明的对药物敏感的动应尽可能首先考虑急毒试验已证明的对药物敏感的动物或品系物或品系 b.其次考虑受试动物的易获得性，是否具有可查阅的生其次考虑受试动物的易获得性，是否具有可查阅的生理、生化等指标的背景资料及该动物毒代动力学与人理、生化等指标的背景资料及该动物毒代动力学与人是否相似。是否相似。实验动物 现阶段，常按传统习惯，选择易得，易饲养管理、饮食习惯现阶段，常按传统习惯，选择易得，易饲养管理、饮食习惯与人接近或吃一般的食物就可以正常生存的常规动物。与人接近或吃一般的食物就可以正常生存的常规动物。啮齿类：大鼠首选，豚鼠、地鼠亦用。啮齿类：大鼠首选，豚鼠、地鼠亦用。非啮齿类：狗最常用（一类药必须用非啮齿类：狗最常用（一类药必须用beagle狗），猴、猫、狗），猴、猫、兔等亦用兔等亦用。我国药政部门规定的基本原则我国药政部门规定的基本原则 是选用两种动物：啮齿类首选是选用两种动物：啮齿类首选 大鼠，非啮齿类首选狗大鼠，非啮齿类首选狗吸入给药时，猴是首先推荐的动物Wistar 和Sprague-Dewley（SD）大鼠近亲繁殖动物杂交动物杂交一代2起始月（周）龄选择较年轻的或正处于生长发育阶段的动物？啮齿类：起始周龄6W，不超过9W非啮齿类：狗6月龄，不差过12月龄。杂交狗科稍大些，但也不能超过5年。实验动物3、性别及数量 1）性别 a.雄雌兼顾，确定是否存在毒性反应的性别差异 b.特殊情况下，也可仅用一种性别的动物 2）数量原则上应对观察项目进行科学统计学处理常规每组动物数：啮齿类20-40只，非啮齿类4-6只实验动物我国药政部门要求每组动物数：90天以内长毒试验：啮齿类至少20只（雌雄各半）非啮齿类4-6只（雌雄各半）超过90天长毒试验：啮齿类至少40只（雌雄各半）非啮齿类8-10只（雌雄各半）实验动物