肺表面活性物质对哮喘小鼠模型树突细胞功能的调节机制

肺外表活性物质对哮喘小鼠模型树突细胞功能的调节机制【关键词】外表Rlefpulnarysurfatantinregulatingdendritiellfuntinfurineasthadels【Abstrat】AI:TexplretheehanissfexgenuspulnarysurfatantPSinregulatingtheiunityfurineasthadelsanditseffetndendritiell(D)funtinfthespleenftheasthadels.ETHDS:urineasthadelsereestablishedithvalbuin(VA)sensitizatinandhallengeandthedelserenfiredbyhistlgialanalysisflungtissues.FASasusedteasuretheexpressinfD80nDderivedfrthespleenfVAsensitizedandhallengedie.PSasinhaledafterVAhallengeby20g/Lfr2,5,10,15and20in.IL12inDultureediuastestedat2,4,6,12and24handdataereanalyzedithSPSS10.0sftare.RESULTS:Histlgialanalysisresultsflungtissueserensistentiththeharateristisfurineasthadel.TheexpressinratefD80nspleenderivedDinasthagrupsignifiantlyinreasedparediththatinPSgrup(P0.01)andD80expressinrateasthelesthenPSasinhaledfr2in.IL12inasthagrupdereasedparediththatinPSgrup(P0.01).PSgrupkeptIL12atahighlevelfralngtiehileIL12expressinlevelaslandlastedfrashrttieinasthagrup.NLUSIN:AbnralDfuntinisexistentinurineasthadelsandexgenussurfatantanregulatetheDfuntinbysuppressingtheexpressinfD80nDandinreasingthelevelfIL12seretedbyD,hihaniprvetherespiratryfuntinhentheasthaishallenged.【Keyrds】pulnarysurfatant；dendritiell；stiulatryleules；IL12；astha【摘要】目的：研究外源性肺外表活性物质对小鼠哮喘模型的免疫调节作用及其对树突细胞D功能的影响.方法：BALB/小鼠50只，分为3组：哮喘组15只采用卵蛋白VA致敏和激发、对照组15只以生理盐水代替VA致敏和激发、治疗组20只每次VA激发后10in以肺外表活性物质PS20g/L雾化吸入，时间为2,5,10,15和20in.用HE染色方法评定哮喘模型.别离培养脾脏D，用流式细胞仪FAS检测D外表共刺激分子D80的表达变化.取D培养液3L，参加VA，调整VA浓度至10g/L.分别在2，4，6，12，24h取D培养液，1300r/in离心5in，取上清液，ELISA法检测IL12P70.结果：哮喘组小鼠的肺组织表现为嗜酸细胞及淋巴细胞浸润为主的炎症变化，治疗组和对照组无此变化.哮喘组D阳性表达率明显高于治疗组(P0.01)；吸入PS对D外表共刺激分子的抑制作用在2in时最强.哮喘组D上清液IL12低于治疗组(P0.01)；治疗组D上清液IL12可以在高程度维持较长时间，而哮喘组的D上清液IL12含量降低，且维持时间较短.结论：小鼠哮喘模型中存在明显的D功能缺陷；外源性吸入PS，能明显改善D功能，从而保护哮喘发作时小鼠的肺功能.【关键词】肺外表活性剂；树突细胞；共刺激分子；白细胞介素12；哮喘0引言支气管哮喘(简称哮喘)是一种慢性气道炎症,其中D4+T淋巴细胞异常活化起关键作用.肺外表活性物质(pulnarysurfatant，PS)是由肺泡型细胞合成、分泌的脂蛋白,具有降低外表张力、维持肺泡稳定性作用.研究说明,哮喘发作时气道中的PS存在量和功能的异常1,从而加重气道阻塞,而外源性补充PS可明显减轻病症，改善肺功能.体外研究发现,PS的脂质成分具有抗炎及免疫调节作用2.树突状细胞(dendritiell，D)是体内强有力的专职抗原提呈细胞.D通过H和共刺激分子与Th0互相作用，提呈抗原给T淋巴细胞(T)，并通过产生细胞因子(如IL12)诱导Th1或Th2型免疫.IL12可诱导强烈的Th1应答反响，其在维持Th1/Th2平衡方面起关键作用3.我们从外源性吸入肺外表活性物质调节D功能方面讨论其治疗支气管哮喘的免疫学机制.1材料和方法1.1材料46k龄BALB/小鼠(第四军医大学动物研究中心)50只，体质量1620g，雌雄不拘.402型超声雾化器；卵蛋白(VA)Grade2，Siga公司.IL12P70ELISA试剂盒博士德公司；PE大鼠IgG和PED80AbSuthernBiteh公司.1.2方法1.2.1小鼠哮喘模型的建立将小鼠分为3组.A组：安康对照组15只，室温下常规饲养；B组：哮喘组15只，小鼠分别于第1，3，5，7，9，11，13日腹腔注射VA10g；第45日时，将每只小鼠单独置于5L密闭容器中，以10g/LVA进展雾化吸入激发5in，持续6d；组：治疗组20只，取15只小鼠在每次激发哮喘前吸入肺外表活性物质(PS)2in，其他同B组.其余5只小鼠在每次激发前吸入PS，分别吸入1，2，5，10和20in.B，组小鼠最后1次激发24h后同A组小鼠一起用40g/L戊巴比妥腹腔麻醉，翻开胸腔，观察肺脏；将5号输液器针头刺入右心室，同时将右心房剪一缺口，9g/L盐水和40g/L多聚甲醛液依次进展内灌注，剪取部分肺组织，切片，HE染色.1.2.2脾脏D的别离、培养参照文献4，取B，组小鼠各10只，在最后一次激发后24h处死小鼠，无菌翻开腹腔，取出脾脏放入冷PBS50L中，将其捻碎，过滤100目无菌钢网，搜集脾细胞悬液；1300r/in洗涤5in3次；用完全培养基20L重悬细胞于100L培养瓶中，37，5L/L2孵育2h；用完全培养基20L剧烈洗摇培养瓶，吸弃悬液，反复共4次；37,50L/L2孵育过夜；搜集悬浮细胞备用.1.2.3D外表分子D80的检测将1.2.2中B，组小鼠新颖制备的D1106个参加1.5LEp管中，参加PBS，2000r/in洗涤5in2次；参加PED80Ab0.2pg，空白对照管参加PE大鼠IgG溶液0.2pg；4放置30in；参加PBS，2000r/in洗涤5in3次；吹打混匀细胞，进展FAS分析.1.2.4吸入不同剂量PS对DD80阳性表达率的影响取组5只小鼠，分别在激发前吸入PS1，2，5，10和20in.吸入浓度皆为20g/L.然后重复上述步骤，最后得出吸入PS不同剂量与DD80阳性表达率的关系曲线.1.2.5D上清液IL12的检测取1.2.2中B，组树突细胞培养液3L，参加VA，调整VA浓度至0.01g/L.分别在2，4，6，12，24h取培养液，1300r/in离心5in，取上清液，ELISA法检测IL12P70.统计学处理：采用SPSS10.0软件进展统计分析，计算样本xs，两样本均数比拟采用t检验.P0.05差异有显著意义.2结果2.1肺切片HE染色B组小鼠肺切片HE染色可见支气管上皮细胞肿胀、脱落,管壁增厚,管腔变窄,管壁内及管周有大量炎性细胞浸润,以嗜酸粒细胞和淋巴细胞为主；组小鼠的肺组织可见支气管上皮的炎症反响较B组轻，支气管壁及管腔内嗜酸粒细胞和淋巴细胞也大为减少；A组小鼠的肺组织那么无上述改变图1.图1小鼠肺组织HE染色HE2002.2D外表共刺激分子D80表达率脾脏提取的D在24h已完全贴壁，倒置显微镜下观察显示，大部分细胞表现为球形突起，少数细胞有梭状分支.经流式细胞仪检测，B组D外表共刺激分子D80表达率为85.372.37%，组78.283.71%，二者相差显著P0.01.2.3不同剂量吸入PS对DD80阳性表达率的影响吸入PS1，2，5，10，20in后，DD80阳性表达率分别为80.21%，72.31%，73.12%，75.12%和78.12%.PS抑制小鼠哮喘模型DD80阳性表达率与PS的吸入剂量有关，在20g/L吸入浓度下，吸入2in效果最正确.2.4D上清液中IL12P70组D上清液IL12可以在高程度维持较长时间，而B组的D上清液IL12含量降低，且维持时间较短图2.图2树突细胞培养基上清液中IL12的含量3讨论PS异常可能是哮喘气道炎症加重的重要原因.治疗哮喘的一些传统药物如类固醇、肾上腺素受体冲动剂等都具有促进PS合成和分泌的作用，它们的疗效可能部分与PS有关.我们的研究发现，经预防性吸入PS，可明显降低哮喘小鼠的气道炎症，减轻气道水肿及支气管痉挛.这与国外的研究报道一致5.D为D4+T细胞活化所必需.D广泛分布于皮肤、胃肠道、气道等外来物质入侵的第一线位置，形成广泛的细胞网络，并在该处固有细胞之间伸出触角以增加识别抗原的时机，且不成熟D表达各种受体，如型凝聚素受体、免疫球蛋白受体和补体受体，介导胞饮作用或吞噬作用以摄取抗原6.D内的特异性H分子对抗原进展加工和处理而形成抗原肽H复合物.且D将从外周组织中所摄取抗原运送至输出淋巴结的T细胞区，尽管其他类型的细胞，如巨噬细胞也能将抗原运送至输出淋巴结，但将抗原直接运送至T细胞区是D特有的功能.D4+T细胞活化需两个刺激信号7.在输出淋巴结内，D外表的抗原肽H复合物与T细胞外表的TR特异性结合，同时D表达共刺激分子D80和D86，与T细胞上的D28结合形成D80/D86D28共刺激通路.故D能为D4+T细胞活化提供所需的特异性抗原识别信号和共刺激信号两个刺激信号，对哮喘D4+T细胞活化是必不可少的.我们的研究发现，外源性吸入PS，可以抑制哮喘小鼠DD80的阳性表达率，进而抑制了哮喘过程中D4+T细胞的活化.IL12是Th1分化细胞因子，D分泌IL12诱导强烈的Th1分化，并产生Th1型细胞因子IFN，后者反过来增强D表达IL12，从而形成正反响，增强Th1应答反响.由于哮喘患者存在D功能异常，合成IL12减少，从而引起T释放IL4过量和IFN缺乏8.本文研究说明，外源性吸入PS可增强D分泌IL12的功能，治疗组D培养基中检测的IL12明显高于哮喘组，并且可以使D高分泌IL12的功能维持较长时间程度，而哮喘组的IL12程度那么明显减低.PS中磷脂成分的主要作用为降低肺泡外表张力，但也发现具有部分肺部免疫调节作用.我们先前的实验验证了吸入PS可减轻哮喘发作，并观察到气道部分EGF及EGFRNA表达相应降低.故我们认为，PS可能通过降低支气管及肺组织EGF的表达，减轻了哮喘发作及相关病理学改变9.目前替代治疗所用PS主要成分为磷脂，通过对PS替代产品功能的分析，可以认为磷脂对肺部免疫的调节以抑制作用为主.在研究中我们发现，外源性吸入PS，能明显的抑制小鼠哮喘模型D外表共刺激分子D80的表达，进而抑制了D的迁移与成熟.在哮喘组D上清液IL12低于治疗组.治疗组树突细胞上清液IL12可以维持较长时间，而哮喘组的树突细胞上清液IL12含量降低，且维持时间较短.以上结果说明，小鼠哮喘模型中存在明显的D功能缺陷.外源性吸入PS，能明显改善D功能，从而保护了哮喘发作时小鼠的肺功能，这为外源性吸入PS治疗哮喘提供了根据.【参考文献】1Sarah，Peter.Alteredairaysurfatantphsphlipidpsitinandredued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