口腔清洁护理用品 牙膏中十六烷基氯化吡啶（CPC）的测定 高效液相色谱法（编制说明） （征求意见稿

口腔清洁护理用品 牙膏中十六烷基氯化吡啶（CPC）的测定 高效液相色谱法编制说明（征求意见稿）一、工作简况1、任务来源本项目是根据工业和信息化部2018年第一批行业标准制修订和外文版项目计划，工信厅科20183号，计划编号2018-0079T-QB，项目名称“口腔清洁护理用品 牙膏中十六烷基氯化吡啶（CPC）的测定 高效液相色谱法”进行制定，主要起草单位：广州薇美姿实业有限公司、广州质量监督检测研究院，计划完成时间为2019年。2、主要工作过程（1）起草阶段：2018年1月，广州薇美姿实业有限公司按照全国口腔护理用品标准化技术委员会牙膏分技术委员会，转发的工业和信息化部2018年第一批行业标准制修订和外文版项目计划的要求，成立了标准起草工作组。工作组在前期对国内外十六烷基氯化吡啶（CPC）在牙膏中应用现状与发展情况进行全面调研，广泛搜集和检索了国内外十六烷基氯化吡啶的分析测试技术资料，并进行了大量的研究分析、资料查证及方法的确认工作，在此基础上，编制出口腔清洁护理用品 牙膏中十六烷基氯化吡啶（CPC）的测定 高效液相色谱法的标准草案初稿。于2018年6月形成了标准工作组讨论稿，经组长审核后，分别发到国家轻工业牙膏蜡制品质量监督检测中心、广州质量监督检测研究院、浙江方圆检测集团股份有限公司进行方法的验证工作。（2）征求意见阶段：经标委会秘书处同意，2018年x月x日，发送到行业有关单位广泛征求意见。截止2018年x月x日，共发函x个单位，收到X个单位回函，其中X个单位提出了X条意见或建议。（3）审查阶段：通过对这些反馈意见进行分类、归纳、整理和分析，工作组采纳  条，部分采纳X条，未采纳X条，并对标准征求意见稿进行了补充、修改，于2018年x月x日，完成了标准送审稿，提交全国口腔护理用品标准化技术委员会牙膏分技术委员会。全国口腔护理用品标准化技术委员会牙膏分技术委员会于201x年x月x日x日在x召开了xx会议，会上组织标委会全体到会委员对本标准进行了审查，获得一致通过。（4）报批阶段：工作组按照会议审查意见对标准送审稿作了进一步的修改、整理和完善，于201x年x月x日，形成了标准报批稿，报标委会秘书处。3、主要参加单位和工作组成员及其所做的工作等本标准由广州薇美姿实业有限公司和广州质量监督检测研究院负责起草。主要成员：所做的工作：XXX任工作组组长，主持全面协调工作。XXX为本标准主要持笔人，负责本标准的起草、编写。XXX为组员，负责对国内外十六烷基氯化吡啶的分析测试技术的现状与发展情况进行全面调研，进行研究分析、资料查证等工作。二、标准编制原则和主要内容1、标准编制原则 本标准的修订符合产业发展的原则，本着先进性、科学性、合理性和可操作性的原则以及标准的目标、统一性、协调性、适用性、一致性和规范性原则来进行本标准的修订工作。本标准起草过程中，主要按GB/T 1.12009标准化工作导则 第1部分：标准的结构和编写和GB/T 1.22002标准化工作导则 第2部分：标准中规范性技术要素内容的确定方法进行编写。本标准修订过程中，主要参考了以下标准或文件：GB/T 1.12009  标准化工作导则 第1部分：标准的结构和编写GB/T 1.22002  标准化工作导则 第2部分：标准中规范性技术要素内容的确定方法GB/T 6682-2008  分析实验室用水规格和试验方法2、标准主要内容本标准规定了高效液相色谱法测定牙膏中十六烷基氯化吡啶的方法要点、试剂与标准物质、仪器、分析步骤、结果计算、回收率和标准偏差等技术内容。2.1 主要技术路线称样加溶剂涡旋震荡分散超声提取取上清液滤膜过滤进行HPLC分析。2.2 样品前处理条件的选择与优化2.2.1 分散方式的选择由于牙膏中含有羧甲基纤维素、黄原胶、卡拉胶等大分子量胶体，加入有机溶剂后，牙膏中胶体与固体摩擦剂迅速凝固成较硬的块体，采取磁力搅拌器以及超声处理，很难实现有效萃取。当采用纯水溶剂时，虽然可使膏体较好分散，但牙膏中大分子胶体溶解在水中，增加了过滤难度。较多方法将牙膏直接称入容量瓶中，然后加入溶剂进行分散，然而该方法在实际称量操作中存在诸多不便，且将磁子加入容量瓶搅拌分散较慢，在样品量较多时影响检测效率。综上考虑，我们采取有机溶剂+水的溶剂组合，兼顾膏体分散及后续过滤操作，另外，将膏体直接称入离心管中，加入一定量溶剂后，加入玻璃珠涡旋震荡，可快速、有效实现膏体分散，在此基础上进一步超声萃取，对目标成分进行有效提取。2.2.2 提取溶液浓度的确定由于牙膏含有大量的增稠剂，用水分散时，若水比例较大，一些增稠剂溶入水中，不利于膜过滤；水比例太小，牙膏结块较硬，又不利于膏体分散均匀。按照样品的处理过程，分别考察60%、70%、80%、90%的甲醇浓度对牙膏中十六烷基氯化吡啶的提取效果比较，其结果如表1所示，结果显示，当甲醇的用量为80%时，能达到较好的提取效果。表1 不同浓度的甲醇对十六烷基氯化吡啶提取效率的比较提取液60%甲醇70%甲醇80%甲醇90%甲醇CPC检测含量4500 mg/kg4800 mg/kg4900 mg/kg4700 mg/kg2.2.3 提取时间的确定称取一定量牙膏样品，加入80%甲醇溶液，涡旋震荡，充分分散，然后用超声萃取0 min、5 min、10 min、15 min、20 min，过有机滤膜，测定峰面积，发现样品在超声萃取10 min后检测，峰面积几乎没有变化，因此，最终确定超声萃取时间为10 min，以保证目标物被有效萃取。2.2.4 称样量的确定在样品测试过程中发现，牙膏称样量对目标物的加标回收率影响较大，因此，进一步考察称样量的影响，确定最佳称样量，结果如表2所示，称样量为0.5 g时，样品加标回收率较高，因此，确定最佳称样量为0.5g。表2 样品称样量对加标回收率的影响（n=6）称样量（g）0.51.01.52.0加标回收率（%）99.5890.3887.1086.992.2.5 最终样品前处理条件称取牙膏0.5 g（精确至0.001g）于50 mL离心管中，加入34颗玻璃珠，再加入20 mL80%甲醇水溶液，涡旋震荡至膏体充分分散，再超声提取10 min，取上清液过0.45 m有机相滤膜。2.3 仪器分析条件的选择和优化2.3.1 色谱柱的选择图1 十六烷基氯化吡啶分子结构图由于十六烷基氯化吡啶是含有疏水性直链烷基的阳离子表活，具有较强的极性，相关文献报道中主要采用C8色谱柱、CN柱以及C18色谱柱。前期工作中，我们首先采用C18色谱柱进行检查，C18色谱柱在多次优化流动相后，色谱峰仍存在严重拖尾，较难得到对称性良好的峰形。近年来，亲水作用色谱逐渐得到更多的应用，对分离强极性物质具有较好的效果，因此，我们尝试采用Waters ACQUITY BEH Amide柱进行检测。Waters ACQUITY BEH Amide色谱柱能达到很好分离，且在初始检测中可以得到对称性良好的色谱峰，但随着进样次数增多及使用时间延长，该色谱柱柱效下降明显，色谱峰拖尾因子增加，影响与牙膏中其他物质分离。进一步，我们采用氰基柱进行检测，在优化流动相条件后，该色谱柱可较好实现目标物与牙膏中其他物质分离，出峰较快，响应值高，且峰形良好。因此，最终选择氰基柱进行检测2.3.2 检测波长的确定在相关文献报道中有提出，十六烷基氯化吡啶的最大吸收波长在260 nm左右，为进一步确定该条件，以甲醇为溶剂配制一定浓度的十六烷基氯化吡啶标准溶液于TECAN酶标仪上进行吸光度扫描，吸收光谱图如图2所示，其最大吸收波长为max=260nm。图2 十六烷基氯化吡啶吸收光谱图2.3.3 流动相的确定流动相的选择和配比决定了目标物的分离和检测时间。前期工作中，我们采用甲醇和水做为流动相，目标物保留时间长导致严重拖尾。根据相关文献报道，进一步采用25 mM四甲基氢氧化铵溶液（乙酸调pH5.0）和甲醇做流动相，通过调整流动相比例，以保留时间、理论塔板数以及能否与牙膏样品中干扰物分离等参数为指标，筛选最佳流动相比例，结果见表2。 表2 不同比例流动相条件下色谱峰参数流动相比例保留时间（min）USP理论塔板数USP拖尾牙膏样品中峰分离否甲醇（%）25 mM四甲基氢氧化铵（%）70306.5648882.13是80203.6375161.82是90103.19100051.56是从表中可以看出，在流动相条件90%甲醇/10%四甲基氢氧化铵（25mM）时，具有较优的理论塔板数，且保留时间合适，利于目标峰同牙膏中干扰峰分离。不同流动相条件下十六烷基氯化吡啶对照品色谱图如图3a，阳性牙膏试样色谱图如图3b。图3a十六烷基氯化吡啶对照品色谱图图3b 牙膏样品中十六烷基氯化吡啶色谱图2.3.4 优化后的仪器条件由于本实验室方法开发使用仪器为超高效液相色谱仪，所优化后条件为UPLC适用条件，考虑方法适用性，由广州质量监督检测研究院完成UPLC条件向HPLC色谱条件转换。其中，方法前处理条件不变，主要对流动相流动相比例进行调整，根据HPLC仪器常规流速及进样量进行设置，并对该条件进行方法验证，详细参数设定如下表3：表3 UPLC与HPLC条件下色谱峰参数仪器参数UPLC条件HPLC条件色谱柱Waters ACQUITY UPLCHSS CYANO 1.8 m, 2.1mm 100 mm具有同等分离效果氰基柱流动相甲醇:25mM四甲基氢氧化铵=90/10（V:V）甲醇:25mM四甲基氢氧化铵=80/20（V:V）流速（mL/min）0.31.5进样量（L）520检测波长（nm）260260柱温（）30303 分析方法的性能考核3.1 方法的线性关系配制2.5 g/mL、6.25 g/mL、12.5 g/mL、25 g/mL、50 g/mL、100 g/mL、200 g/mL的十六烷基氯化吡啶标准溶液系列，然后进样分析。考察十六烷基氯化吡啶的峰面积和浓度的线性关系，如表4所示。可见十六烷基氯化吡啶浓度2.5200 g/mL范围内，呈现良好的线性关系。表4对照品十六烷基氯化吡啶的回归方程、相关系数线性方程相关系数R线性范围（g/mL）Y=3436.7X-1821.30.99992.5-2003.2 方法检出限、定量限的确定向不含十六烷基氯化吡啶的空白牙膏基质中添加十六烷基氯化吡啶标准溶液，按照标准处理方法处理后，测定峰高信噪比为101时添加的十六烷基氯化吡啶的量，确定本方法的最低定量限为0.7 g/mL；测定峰高信噪比为31时添加的十六烷基氯化吡啶的量，确定本方法的最低检出限为0.2 g/mL。表4 十六烷基氯化吡啶的检出限、定量限、检出浓度和定量浓度目标物检出限g/mL定量限g/mL检出浓度mg/kg定量浓度mg/kg十六烷基氯化吡啶0.20.78283.3 方法的回收率对3种不同空白基质牙膏，进行加标回收试验，每个添加浓度按照确定的分析方法做6次平行测定，并计算回收率和相对标准偏差（即精密度）。结果表明十六烷基氯化吡啶的回收率在92.7%99.7%之间，相对标准偏差RSD在0.73%3.60%之间，方法重现性良好。加标回收率二氧化硅碳酸钙磷酸氢钙添加浓度(mg/kg)100700150010070015001007001500测定结果（mg/kg）197.3700.61496.496.3680.61488.189.3690.11478.2298.6705.11506.799.6694.11470.990673.31471.2399.1695.41504.295.1675.81496.292.4674.81488.5496.5688.81480.194.5684.61481.393.5684.41465.5597.4694.71494.693.4697.71498.492.4687.21463.4699.8701.21482.397.8670.51515.298.7671.91487.2平均值mg/kg98.1697.61494.196.1683.91491.792.7680.31475.7平均回收率(%)98.199.799.696.197.799.492.797.298.4RSD(%)1.280.830.732.371.541.033.601.160.73  3.5 同一样品检测重复性取牙膏样品，做6平行，测定方法重复性。序号样品CPC含量(mg/kg)平均值(mg/kg)相对标准偏差(%)1472046801.70245303471044.675467064760通过实验，样品的十六烷基氯化吡啶含量在4680 mg/kg,相对偏差为1.70%，结果表明方法重复性好。5 实际样品的测试样品种类序号样品名称十六烷基氯化吡啶含量%漱口水1xx双重薄荷漱口水0.0502xx清心绿茶漱口水0.0753xx护龈晶盐漱口水0.0504xx冰爽薄荷漱口水0.0485xx鲜果薄荷漱口水0.0746xx草本盐爽漱口水0.0697xx全效漱口水0.0708xx士漱口水0.0729xx草莓味漱口水0.01010 xx护理漱口水0.048牙膏11xxcheck up儿童牙膏0.00812xx 米菲儿童牙膏0.01013xx香草薄荷牙膏0.04214xx草本薄荷牙膏0.04115xx西瓜霜卓效亮白牙膏未检出16xx四味中药牙膏未检出17xx抗敏感牙膏未检出18xx清火牙膏未检出19xx固齿牙膏未检出20 xx亮齿白牙膏未检出三、主要试验（或验证）情况本方法邀请了3家有资质的检测机构质检科分别进行了方法验证工作，验证报告见附件。验证结果显示，在重复性实验条件下，三家实验室标准工作曲线的线性良好，线性相关系数R在0.9999以上；不同基质、高中低三种浓度回收率均能满足标准文本的回收率要求，平均回收率在93.8%100.2%之间；数据的精密度良好，相对标准偏差在0.493.03%以内。实验室间样品测试情况见下表，三个样品不同实验室测试值相对标准偏差在5.0%以内，方法的精密度高。样品名称国家轻工业牙膏蜡制品检测中心广州质量监督检测研究院浙江方圆检测集团股份有限公司平均值RSD(%)xx牙膏（香草薄荷）（mg/kg）478.1492.3519.4496.64.2xx米菲儿童牙膏（水果味）（mg/kg）106.799.5109.0105.14.7xx 漱口水（清心绿茶）（mg/kg）744.3729.6738.2737.41.0四、标准中涉及专利的情况本标准不涉及专利问题。五、预期达到的社会效益、对产业发展的作用等情况本标准为制定项目，采用先进的高效液相色谱技术，解决了牙膏中十六烷基氯化吡啶含量的测定问题。十六烷基氯化吡啶是一种高效广谱杀菌剂，广泛应用于各类牙膏和漱口水中，有效抑制口腔中厌氧菌等细菌，能够帮助抑制牙菌斑的积累和牙龈发炎。虽然十六烷基氯化吡啶在牙膏中的使用没有限量要求，但十六烷基氯化吡啶具有一定毒性，牙膏产品中过量添加CPC可能给消费者健康带来隐患。目前，国内口腔护理产品中西吡氯铵的检测尚无相关地方或行业标准，本次报批的口腔清洁护理用品 牙膏中十六烷基氯化吡啶的测定 高效液相色谱法，是对牙膏中有效成分检测方法的重要补充。通过制订该标准，可以更好地为行业、企业服务，有利于产业结构调整和升级。六、与国际、国外对比情况本标准没有采用国际标准。本标准制定过程中未查到同类国际、国外标准。本标准水平为国内先进水平。七、在标准体系中的位置，与现行相关法律、法规、规章及标准，特别是强制性标准的协调性本专业领域标准体系框图如下图。本标准属于口腔清洁用品标准体系“牙膏”小类，“口腔护理用品”组，“方法标准”系列。本标准与现行相关法律、法规、规章及相关标准协调一致。505日用化学制品08 口腔清洁用品09家用其他化学制品01 油墨0801牙膏02中草药牙膏03牙刷080101口腔护理用品080103口腔护理用原辅材料080104口腔护理用品生产设备080102口腔护理器具08010401产品标准08010402基础标准08010403管理标准08010201产品标准08010202基础标准08010203管理标准08010204方法标准08010301产品标准08010302基础标准08010303管理标准08010304方法标准08010101产品标准08010102基础标准08010103管理标准08010104方法标准标准体系框图八、重大分歧意见的处理经过和依据无。九、标准性质的建议说明建议本标准的性质为推荐性行业标准。十、贯彻标准的要求和措施建议建议本标准批准发布6个月后实施。建议本标准由全国口腔护理用品标准化技术委员会牙膏分技术委员会组织宣贯实施，企业可按照行业标准的规定和要求对企业内部标准进行修订，或根据行业标准实施时间要求拟订企标整改过渡措施。十一、废止现行相关标准的建议无。十二、其他应予说明的事项无。