第五章环境化学物的特殊毒性及其评价

第五章第五章 环境化学物的特殊毒环境化学物的特殊毒性及其评价性及其评价第一第一节节 环境环境化学物的致突变性及其评价化学物的致突变性及其评价一、概述一、概述 物种的各个体和各代之间的种种变化称为变异。可遗传变异即称为突变（mutation）。有自发的和诱发的。 相当多的外来化学物能直接损伤DNA或产生其他遗传学改变而使基因和染色体发生改变遗传毒物或致突变物或诱变剂。二、突变的类型二、突变的类型突变的基础是遗传物质的DNA改变，根据DNA改变牵涉的范围大小，可以将遗传损伤分为三类：基因突变、染色体突变和基因组突变。（一）基因突变 指在基因序列中DNA序列的改变，也叫点突变。 1、碱基置换 碱基置换指DNA序列上的某个碱基被其他碱基取代。首先在DNA复制时会使互补链的相应位点配上一个错误的碱基，即发生错误配对。这一错误配上的碱基在下一次DNA复制时却能按正常规律配对，于是一对错误的碱基置换了原来的碱基对，亦即最终产生碱基对置换或简称碱基置换。 转换（转换（transition）：嘌呤与嘌呤碱基之间的置换，或嘧）：嘌呤与嘌呤碱基之间的置换，或嘧啶与嘧啶之间的置换。啶与嘧啶之间的置换。颠换（颠换（transversion）：嘌呤与嘧啶碱基之间的置换。）：嘌呤与嘧啶碱基之间的置换。 2、移码 移码是从mRNA到蛋白质翻译过程中遗传密码子读码顺序的突变，通常是基因中增加或减少了一对或几对不等于3的倍数的碱基对所造成的突变。3、整码突变 指在DNA中增加或减少的碱基对为一个或几个密码子。4、片断突变 指基因中某些小片断核苷酸序列发生改变。这种损伤有时可跨越两个或数个基因。片断突变包括缺失、重复、重组、重排。（二）染色体突变 也称染色体畸变，是染色体或染色体单体受损而发生断裂，且断端不发生重接或虽重接却不在原处。能使染色体或染色单体发生断裂的物质称为断裂剂，这种作用的发生及其过程称为断裂作用。断裂作用的关键是诱发DNA链断裂。（1）裂隙（gap） 在染色体上出现无染色质的区域，但该区域两端的染色体仍保持线状连接者为裂隙。一般认为裂隙属于非染色质损伤。裂隙不计入畸变范围。（2）断裂（break） 指染色体上狭窄的非染色带,无线状连接者为断裂。（3）断片（fragment）和 缺失（deletion） 一个染色体发生一次或多次断裂而不重接，并且这些已断裂的节段远远分开，常将无着丝粒断片简称为断片。 有着丝粒的部分称为缺失，缺失有末端缺失和中间缺失。（4） 微小体（minute body） 中间缺失如断片很小，小于染色单体宽度，呈圆点状，称为微小体。（5）无着丝粒环（acentric ring） 一条较长的无着丝粒断片的两端连接，就形成无着丝粒环。（6）环状染色体（ring chromosome） 染色体两臂各发生一次断裂，其带有着丝粒的节段的两断端连接形成一个环时，称为环状染色体。（7）双着丝粒染色体（dicentric chromosome） 两条染色体断裂后，两个有着丝粒的节段重接形成。（8）倒位（inversion） 当某一染色体发生两次断裂后，其中间节段倒转180再重接，称为倒位。臂间倒位：颠倒的是具有中间着丝粒的中间节段 臂内倒位：颠倒的是长臂或短臂内的一段（9）易位（translocation） 两个非同源染色体断裂后，从某个染色体断下的节段接到另一染色体上称为易位。 两条染色体同时断裂，相互交换断片并重接相互易位 仅一个染色体节段连接到另一染色体上单方易位； 三个或三个以上染色体断裂、重接复杂易位（10）插入（insertion）和重复（duplication） 当一个染色体发生三处断裂，带有两断端的断片插入到另一臂的断裂处或另一染色体的断裂处重接起来，称为插入。 如此时有缺失的染色体和有插入的染色体是同源染色体，且分别有一处断裂发生于同一位点，则插入将使该染色体连续出现两段完全相同的节段，此时称为重复。（11）辐射体 染色体间的不平衡易位可形成三条臂构型或四条臂构型，分别称为三辐射体和四辐射体。在多个染色体间的单体互换可形成复合射体。（三）基因组突变 指基因组中染色体数目的改变，也称染色体数目畸变。1、非整倍体 指细胞丢失或增加一条或多条染色体。缺失一条染色体称为单体，增加一条染色体称为三体。2、整倍体 指染色体数目的异常是以染色体组为单位的增减，如三倍体、四倍体。三、致突变作用机理三、致突变作用机理 外源化学物引起基因突变和染色体突变的靶部位主要是DNA，而导致染色体数目异常的靶部位主要是有丝分裂和减数分裂器，如纺锤丝。（一）（一）DNA损伤和突变损伤和突变1、碱基类似物的取代 有些化学物的结构与碱基非常相似，称碱基类似物。它们能可与天然碱基竞争，并取代其位置，而掺入到DNA分子中，引起剑姬配对特性的改变，引发突变。2、与DNA分子共价结合形成加合物 许多亲电子性化学物可与DNA作用形成加合物（adduction）。不同诱变剂与DNA作用的碱基位置不同，可引起不同类型的突变。 烷化剂可提供甲基或乙基等烷基，与DNA发生共价结合。对DNA和蛋白质都有强烈烷化作用。各类烷化剂烷化活性有别，一般情况下甲基化乙基化高碳烷基化。3、改变或破坏碱基的化学结构某些诱变剂可与碱基发生相互作用，使碱基发生化学结构变化，引起错误配对或引起DNA链断裂。例如，亚硝酸根能使腺嘌呤和胞嘧啶发生氧化性脱氨，相应变为次黄嘌呤和尿嘧啶。4、大分子嵌入DNA链 如吖啶类染料（吖啶橙），是一种平面型三环分子，结构与一个嘌呤-嘧啶对十分相似，能嵌入两个相邻的DNA碱基对之间，造成移码突变。(二二)非整倍体及整倍体的诱发非整倍体及整倍体的诱发 非整倍体畸变的原因：（1） 不分离：同源染色体在第一次减数分裂中不分离；姐妹染色体在第二次减数分裂或有丝分裂中不分离。（2）染色体丢失 由于纺锤体形成不完全或着丝粒受损使得染色体在分离过程中没有进入任一个子细胞核中。 整倍体诱发的原因1、纺锤体受损，有丝分裂染色体组不分离，形成四倍体；2、减数分裂异常使配子形成二倍体，若二倍体的配子受精，可形成多倍体受精卵；3、一个卵子被多个精子受精，形成多倍体。（三）（三）DNA损伤的修复和突变损伤的修复和突变1、生物体、生物体DNA损失修复系统损失修复系统（1） 复制前的修复过程精确修复，包括直接修复和切除修复a、直接修复：包括光修复和O6甲基鸟嘌呤修复光修复：针对紫外线引起的嘧啶二聚体修复功能，修复的过程是通过在波长范围为320370 mm的可见光中，二聚体可直接恢复成原来的样子。催化光复活反应的酶叫做光裂合酶。O6-甲基鸟嘌呤修复：修复在O6位上含有烷基的鸟嘌呤，靠O6-甲基鸟漂吟-DNA-甲基转移酶将O6-甲基鸟嘌呤的甲基转移至该酶的半胱氨酸残基上，而恢复鸟嘌呤正常的碱基配对特性，该酶在修复过程中被不可逆地失活。 b、切除修复(excixion-repair)由于这过程并不依赖于光的存在故又称为暗修复（dark repair）。依据切除对象的不同，分为核苷酸切除修复（大段异常核苷酸）；碱基切除修复（个别异常碱基）；错配碱基修复 核苷酸切除修复(nucleotide excision repair)是所有生物体内最常见的修复机制。它可修复几乎所有的DNA损伤类型，包括其他修复机制不能修复的加合物及DNA链间交联等。 修复时，先靠内切酶把DNA链从损伤两端切断；在解螺旋酶作用下，除去受损的寡核苷酸；再在修复多聚酶的作用下，以对应的链为模板，以正确的碱基填补空隙；最后在DNA连接酶作用下连接，恢复原来的序列。碱基切除修复：abcde图12-16 DNA碱基切除修复 A：六边型表示错误的碱基：六边型表示错误的碱基 B：DNA糖基化酶切除错误的碱基糖基化酶切除错误的碱基 C：AP内切核酸酶及内切核酸酶及AP裂解酶切除裂解酶切除磷酸二酯链及糖基磷酸二酯链及糖基 D：DNA聚合酶填补单一核苷酸。聚合酶填补单一核苷酸。 E：DNA连接酶封闭连接酶封闭 缺口缺口 错配碱基修复(mismatch base repair)是一种特殊的切除修复形式，通过该机制可去除不正确的碱基配对，如G：T和A：C。（2）复制后修复 这个系统是在DNA复制时模板链上含有损伤的碱基导致子链产生裂缺，这是在复制时产生的，所此修复系统也属于复制后修复。 复制时新合成的互补链相应部位出现空隙，随后以重组作用及链延长作用填补。通过此机制，使DNA合成得以通过损伤部位，避免了致死性的后果，但存在的DNA损伤并末移除，仍有待通过其他的修复机制而修复。 2. DNA损伤修复与突变损伤修复与突变 突变的产生不仅与DNA受损的情况有关，DNA损伤修复也是决定突变发生与否的重要因素。DNA损伤修复功能的缺失或修复能力降低都会使突变的发生明显增加。 不同生物损伤修复功能的类型及能力有所不同，如人类的修复能力比小鼠大10倍左右。在使用元原核生物及动物进行致突变试验，并用其结果外推到人时，要考虑到DNA损伤修复系统的差别。 DNA损伤修复过程涉及许多酶的参与。同代谢酶的多态性一样，DNA损伤修复酶也有多态性，即其基因型或表型存在个体差异。DNA损伤修复酶的多态性在一定程度上影响着个体对遗传毒性因素的易感性。四、突变的不良后果四、突变的不良后果 突变的靶细胞有体细胞和生殖细胞（一）体细胞突变的后果1、癌变2、畸变：胚胎体细胞突变，造成畸胎3、其他不良后果：动脉粥样硬化、衰老。（二）生殖细胞突变的后果1、致死性2、可遗传的改变：显性遗传病、隐性遗传病五、致突变作用的评价五、致突变作用的评价（一）致突变试验的分类（一）致突变试验的分类 目前有200多种，重要的和常规使用的大约20多种。依据检测的遗传学终点的不同，可分为四类：基因突变试验、染色体损伤试验、非整倍体试验和其他反映DNA损伤的试验。（二）常用的致突变试验（二）常用的致突变试验1、细菌回复突变试验 细菌回复突变试验是以营养缺陷的突变体菌株为试验系统，观察受试物引起其回复突变的作用。 常用的菌株： 色氨酸营养缺陷型的大肠杆菌大肠杆菌回复试验 组氨酸营养缺陷型鼠伤寒沙门氏菌Ames实验原理： Ames试验，检测受试物诱发鼠伤寒沙门氏菌组氨酸营养缺陷型突变株(his-)回复突变成野生型(his+)的能力。试验菌株都有组氨酸突变(his-)，不能自行合成组氨酸，在不含组氨酸的最低营养平皿上不能生长，回复突变成野生型后能自行合成组氨酸，可在最低营养平皿上生长成可见菌落。计数最低营养平皿上的回变菌落数来判定受试物是否有致突变性。 2. 哺乳动物细胞基因突变试验 哺乳动物细胞基因突变试验是利用啮齿类和人体外培养细胞的基因正向突变试验。 常用细胞株常用细胞株 选用的基因选用的基因 小鼠淋巴瘤细胞小鼠淋巴瘤细胞L5178Y TK、HPRT 中国仓鼠卵巢组织细胞中国仓鼠卵巢组织细胞CHO HPRT 中国仓鼠肺组织细胞中国仓鼠肺组织细胞V79 HPRT 人淋巴细胞人淋巴细胞 HPRT（1）tk基因 位于常染色体上，编码胸苷激酶，催化胸腺嘧啶脱氧核苷ATP 胸苷酸。存在嘧啶类似物5溴脱氧尿苷时，产生异常核苷酸使细胞死亡。受试物存在时若细胞不死亡说明TK发生突变。（2）hprt基因 位于X染色体上，编码次黄嘌呤鸟嘌呤转磷酸核糖基酶：催化次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖焦磷酸 核苷-5-单磷酸（NMP）。如存在碱基类似物，生成相应的NMP，掺入到DNA中可致死。加入受试物后能存活的细胞表示发生基因突变。3、染色体畸变试验 制备细胞分裂中期相染色体标本，在光镜下可直接观察染色体的数目和形态的改变。染色体畸变试验也常称为细胞遗传学试验(cytogenetic assay)。染色体畸变试验可为体外试验，也可为体内试验，包括对体细胞和生殖细胞的分析。 结构畸变：可观察到裂隙、断裂、断片、微小体、环状染色体、双或多着丝粒染色体和射体。 数目畸变：需在染毒后经过一次有丝分裂才能发现。但是经过一次有丝分裂后，一些结构畸变可能因遗传物质的丢失而致细胞死亡，因此不能发现。所以应安排多次收获时间，以便分别检查断裂剂的作用。体内试验：多观察骨髓细胞，其分裂旺盛、易于获得和制备，优势在于可体现哺乳动物的代谢过程、DNA修复和药物动力学特征。但应注意受试物或其活性代谢产物有可能不易在骨髓中达到足够的浓度。体外试验：常用中国仓鼠肺细胞(CHL)，以及中国仓鼠卵细胞(CHO)和V79等细胞系，但任何细胞系的染色体皆不稳定，不能准确地观察非整倍体，故在体外试验中，如考虑进行染色体数目观察，应当使用原代或早代细胞 4、微核试验 微核是染色体的断片或迟滞的染色体在细胞分裂后期，由于不能进入子细胞的核中而在间期的子细胞胞浆内形成的游离团块物质，它与细胞主核着色一致，圆形或椭圆形。常用啮齿类动物骨髓嗜多染红细胞(PCE)或外周血细胞进行微核试验。PCE是红细胞成熟的一个阶段，此时红细胞的主核已排出，微核容易辩认，PCE胞质含RNA染色与成熟红细胞易于区别，故为骨髓微核试验的首选细胞群。一般采用多次染毒后24h采样。5. 显性致死试验(dominant lethal assay) 显性致死(dominant lethal)指发育中的精子或卵子细胞发生遗传学损伤，导致受精卵或发育中的胚胎死亡。一般认为显性致死主要是由于染色体损伤的结果。显性致死试验以胚胎死亡为观察终点，用于检测受试物对动物性细胞的染色体损伤作用。 一般采用性成熟的雄性大鼠或小鼠接触受试物，然后使之与未染毒的雌性交配，观察胚胎死亡情况。计算出受孕率、总着床数、早期和晚期胚胎死亡率予以评价。 6、小鼠精子畸形试验 精子畸形指精子形态发生异常改变。可导致生育能力的改变。用于检测外源化学物对精子生成和发育的影响，也可用于评价化学物对生殖细胞的致突变作用。 常用68周的小鼠，连续5天染毒。在染毒后不同时间（1、4、10周）处死，取样检查精子形态。7 、 程 序 外 D N A 合 成 试 验(unscheduled DNA synthesis test，UDS) 正常细胞在有丝分裂过程中，仅在S期进行DNA复制合成。 当DNA受损后，DNA的修复合成可发生在正常复制合成期(S期)以外的其他时期，称为程序外DNA合成。用同步培养将细胞阻断于Gl期，并将正常的DNA半保留复制阻断，然后用受试物处理细胞，并在加有3H-胸腺嘧啶核苷的培养液中进行培养。利用放射自显影法或液闪计数法测定掺入DNA的放射活性，检测DNA修复合成，从而间接反映DNA的损伤程度。 8、转基因动物致突变试验 近年来建立的转基因动物致突变检测模型为研究哺乳动物体内基因突变提供了有效的手段，可以在动物个体水平研究突变的器官、组织特异性，包括生殖细胞。并可比较容易地从动物基因组中重新回收导入的基因，进行序列分析。 转基因动物指基因组中整合有用实验方法导入的DNA(可以是完整的基因，也可是不完整的DNA片段)，并能遗传给后代的一类动物。 在进行转基因动物致突变试验时，在染毒后先抽提不同器官或组织的基因组DNA，然后把纯化的基因组DNA与噬菌体体外包装抽提物混合，而将导入的基因载体包装进噬菌体中，用这些噬菌体感染大肠菌，可形成噬菌斑，通过噬菌斑颜色变化进行突变的判断并获得突变子。 （三）致突变试验在预测致癌性及遗传危害性中的价值（三）致突变试验在预测致癌性及遗传危害性中的价值 致突变试验的主要目的是研究外源化学物引起人类生殖细胞的突变并传递给后代的可能性；另外基于体细胞突变与肿瘤有关的认识，也可用于外源化学物潜在致癌性的预测。 虽然致突变试验可用于外源化学物致癌性的筛选，但也存在不足。在致癌性预测时致突变试验适用于遗传毒性致癌物和非遗传毒性非致癌物。对于遗传毒性非致癌物会出现假阳性，对于非遗传毒性致癌物则会出现假阴性。预测遗传学危害也即预测对哺乳动物性细胞的致突变性。哺乳动物性细胞致突变物的标准体内试验需较大的动物数量，且费时、费钱，不可能广泛使用。可利用短期致突变试验对哺乳动物性细胞致突变性及遗传危害性进行预测。 生殖细胞的致突变试验在预测遗传危害性中具有重要的意义。但一般认为，体细胞致突变试验阴性的化学物，在生殖细胞试验中一般也为阴性。所以，一般都是先进行体细胞的诱变性检测，发现部分试验结果阳性或有生殖细胞接触证据时，再进行生殖细胞的诱变性检测。 哺乳动物性细胞致突变性与对人的遗传危害性之间还缺乏直接相关的证据。为评价外源化学物对人类的遗传危害性，遗传流行病学研究是最直接、最可靠的方法，但难度很大。 目前，评价遗传危害主要还是依据致突变试验的结果，特别是体内生殖细胞的致突变试验结果。如果一种化学物在多项致突变试验中证明有致突变性，一般也假定其对人也可能具有遗传危害性。第二节第二节 环境环境化学物化学物的致癌作用及其的致癌作用及其评价评价一、环境致癌与化学致癌一、环境致癌与化学致癌 癌症的发生8090由环境因素引起，包括物理因素、生物因素和化学因素。其中主要是化学因素。在环境因素引起的肿瘤中，80以上由化学因素引起。 化学致癌(chemical carcinogenesis)是指化学物质引起正常细胞发生恶性转化并发展成肿瘤的过程，具有这种作用的化学物质称为化学致癌物(chemical carcinogen)。在此，“癌”的含义包括上皮的恶性变(癌)，也包括间质的恶性变(肉瘤)及良性肿瘤。癌细胞的生物学特点：1、持续性增殖，分化不良，体外培养无接触性抑制接触性抑制。永生性。2、浸润性生长：可侵入其他组织，并发生转移3、过分旺盛地合成核酸和氨基酸4、强烈的有氧酵解：在供氧充分时，仍能将葡萄糖转化为乳酸，大量的乳酸使pH下降，影响细胞酶活力，破坏内稳态的维持。5、可将上述特征遗传给子代细胞二、化学致癌的机制二、化学致癌的机制 尚未彻底阐明，大体可分为遗传机制学说和非遗传机制学说。（一）化学致癌的遗传机制学说 该学说认为，化学致癌物进入细胞后作用于遗传物质，通过引起细胞基因的改变而发挥致癌作用。有关学说最主要的是多阶段学说和癌基因学说。1、化学致癌的多阶段学说 包括引发、促长和进展三个阶段。（1）引发阶段：化学致癌的第一阶段，是化学致癌物本身或其活性代谢物作用于DNA，诱发体细胞突变的过程，可能涉及原癌基因的活化和肿瘤抑制基因的失活。 具有引发作用的化学物称为引发剂。引发剂本身有致癌性，大多数是致突变物，没有可检测的阈剂量，引发作用是不可逆的并且是累积性的。但并非所有的引发细胞都将构成肿瘤，因其中大多数将经历程序性细胞死亡(凋亡)。引发细胞不具有生长自主性，因此不是肿瘤细胞。（2）促长阶段：促长阶段是引发细胞增殖成为癌前病变或良性肿瘤的过程。促长剂单独使用不具致癌性，必须在引发剂后使用才发挥促长作用。促长剂通常是非致突变物，影响引发细胞的增殖，导致局部增殖并引起良性局灶性病理损害如乳头瘤、结节或息肉。这些病损很多会消退，仅少数细胞发生进一步突变引成恶性肿瘤。 特点： 历时较长，早期有可逆性，晚期为不可逆的 对生理因素调节的敏感性，衰老、饮食和激素可影响促长作用。（3）进展阶段：进展阶段是从引发细胞群(癌前病变、良性肿瘤)转变成恶性肿瘤的过程。在进展期肿瘤获得生长加快、侵袭、转移和抗药性等特征。这些特征是由于在进展阶段的核型不稳定性。肿瘤的染色体发生断裂、断片易位和非整倍体。 使细胞由促长阶段进入进展阶段的化学物称为进展剂(progressor)。进展剂可引起染色体畸变，但不一定具有引发活性。引发、促长及进展都可自发发生。有些化学致癌物可同时具引发、促长及进展都可自发发生。有些化学致癌物可同时具有引发、促长及进展的作用，称为有引发、促长及进展的作用，称为完全致癌物完全致癌物。 化学致癌是长期的、复杂的多阶段过程，至少涉及引发、促长和进展三个阶段。在引发阶段主要是细胞原癌基因和肿瘤抑制基因的突变在促长阶段主要是遗传外机制在进展阶段主要是核型不稳定性正常细胞经过遗传学改变的积累才能转变为癌细胞。2、化学致癌的癌基因学说 调控细胞增殖和分化的基因发生异常，可导致细胞持续增殖，不能及时分化和凋亡，形成肿瘤。与细胞恶性转化有关的基因主要有癌基因和肿瘤抑制基因。癌基因：能引起细胞恶性转化及癌变的基因。通常以原癌基因的形式存在正常动物细胞的基因组中。原癌基因：最早在1968年Duesberg发现Rous肉瘤病毒致癌是由于携带能致癌的基因片段，称为病毒癌基因（Vonc），后来发现在正常细胞中也存在与病毒癌基因高度相似的DNA序列，称为原癌基因（C-onc）。正常细胞中的原癌基因表达并不引起恶性病变，其表达受到严格控制，通常与机体的生长和发育有关。原癌基因必须经过激活才能导致细胞的恶性转化。原癌基因是一种显性基因，当其两个等位基因之一发生突变，即可被激活。 肿瘤抑制基因：即抗癌基因。抗癌基因可能是编码抑制生殖、促进分化的基因，也可能是某些基因的负控制调节基因，并是维持基因组织定性的某些基因。抗癌基因可抑制肿瘤细胞的肿瘤性状的表达，只有当自己不能表达或其基因产物去活化才容许肿瘤性状的表达。染色体缺失而诱发肿瘤的基因都可能是肿瘤抑制基因。属隐形基因，必须一对等位基因丢失或突变后失活，才能对细胞的恶性转化起作用。（二）化学致癌的非遗传机制学说 一部分致癌物用目前的致突变试验不能检出其致突变性。这些非遗传毒性致癌物促进细胞分裂增殖的机制多种多样： 具有细胞毒性的致癌剂可引起细胞变性坏死，细胞释放出的物质具有刺激细胞分裂增殖的作用 激素失调导致肿瘤发生，与通过细胞内相应的受体刺激细胞分裂有关 免疫抑制剂可降低机体对癌前细胞的监视和清除能力三、环境化学致癌物的分类三、环境化学致癌物的分类（一）按致癌作用机制分类 可分为遗传毒性致癌物和非遗传毒性致癌物两类。1、遗传毒性致癌物（1）直接致癌物：不需代谢活化直接与亲核分子共价结合形成加合物。这类化合物为亲电子剂，大多数为合成有机物。 （2）间接致癌物： 多数有机致癌物需代谢活化才具有致癌活性，称为间接致癌物。间接致癌物的原型称为前致癌物。前致癌物经代谢活化形成的之间代谢产物近致癌物（半致癌物），有一定致癌作用但必须再一次激活终致癌物（前致癌物经代谢活动形成的具有致癌作用的代谢物和不需代谢活化的致癌物）。（3）无机致癌物 放射性元素和重金属。有些可能是亲电子剂，但有些是通过选择性改变DNA复制保真性，导致DNA的改变，如金属镍、铬。2. 非遗传毒性致癌物(non-genotoxic carcinogens) 非遗传毒性致癌物不与DNA反应，可能间接地影响DNA并改变基因组导致细胞癌变，或者通过促长作用、增强作用导致癌的发展。 （1）促长剂：本身无致癌性，在给以遗传毒性致癌物之后再给以促长剂可增强遗传毒性致癌物的致癌作用，也可促进“自发性”转化细胞发展成癌。 （2）激素调控剂：主要改变内分泌系统平衡及细胞正常分化，常起促长剂作用。 （3）细胞毒剂：可能引起细胞死亡，导致细胞增殖活跃及癌发展。 （4）过氧化物酶体增殖剂：过氧化物酶体增殖可导致细胞内氧自由基过量生成。 （5） 免疫抑制剂：主要对病毒诱导的恶性转化起增强作用。 （6） 固态物质：物理状态是关键性因素，可能涉及细胞毒性。如塑料、石棉等。 （7）助癌物：本身无致癌性，在致癌物之前或同时应用助癌物可显著增加癌症的发生。 助癌作用的机制可涉及增加致癌物的吸收、增加活化的致癌物的比例、耗尽内源性结合反应底物、抑制DNA修复、促进DNA损伤固定为突变等。四、环境化学物致癌物的评价四、环境化学物致癌物的评价(一) 哺乳动物致癌试验 哺乳动物致癌试验是鉴定化学致癌物的标准体内试验。哺乳动物致癌试验用来确定受试物对试验动物的致癌性、剂量反应关系及诱发肿瘤的靶器官。1、实验动物物种和品系：要求用两种实验动物，常规选用大鼠和小鼠，也可用仓鼠。在选择品系时应选择较敏感、自发肿瘤率低、生活力强及寿命较长的品系。性别：应使用同等数量的雌雄两种性别的动物。年龄：使用刚离乳的动物，以保证有足够长的染毒和发生癌症的时间，而且幼年动物解毒酶及免疫系统尚未完善，对致癌作用比较敏感。2、剂量设置 致癌试验一般设三个试验组。高剂量组：最大耐受剂量(MTD)是由90天毒性试验来确定的，此剂量应使动物体重减轻不超过对照组的10，并且不引起死亡及导致缩短寿命的中毒症状或病理损伤。低剂量组：一般不低于高剂量的10。应不影响动物的正常生长、发育和寿命，即不产生任何毒性效应。中剂量组：介于高、低剂量之间，如有可能按受试物的毒物动力学性质来确定。 对照组除不给受试物外，其他条件均与试验组相同。 同时应设阴性(溶剂或赋形剂)对照组。必要时可设阳性对照组，阳性致癌物最好与受试物的化学结构相近。3、染毒途径 尽可能模拟人体可能的暴露途径，主要途径有经口、经皮和吸入三种，应根据受试物的理化性质和接触方式选择确定。4、试验期限 一般情况下，试验期限小鼠和仓鼠应为18个月，大鼠为24个月；然而对于某些生命期较长或自发肿瘤率低的动物品系，小鼠和仓鼠可持续24个月，大鼠可持续30个月。5、观察指标（1）一般观察：每天观察受试动物一次，主要观察其外表、活动、摄食情况等。在实验最初三个月每周称体重一次，以后每两周称体重一次。经饲料或饮水给以受试物时，应记录食物消耗量或饮水量，以计算受试物的摄人量。观察时要注意有无肿瘤出现、肿瘤出现时间及死亡时间。（2）肿瘤发生情况：记录肉眼可见或可触及肿瘤出现的时间、部位、大小、外形、发展状况并记录动物死亡时间。（3）病理检查：动物自然死亡或处死后必须及时进行病理检查，包括肉眼和组织切片检查。6、结果分析主要分析指标有肿瘤发生率、肿瘤潜伏期及肿瘤多发性。肿瘤发生率()=(实验结束时患肿瘤动物总数有效动物总数)100式中，有效动物总数指最早发现肿瘤时存活动物总数。肿瘤潜伏期即从摄入受试物起到发现肿瘤的时间，因为内脏肿瘤不易觉察，通常将肿瘤引起该动物死亡的时间定为发生肿瘤的时间。肿瘤多发性指一个动物出现多个器官的肿瘤或一个器官出现多个肿瘤。 致癌试验阳性的判定标准为WHO提出的标准。WHO(1969)提出机体可以对致癌物有下列一种或多种反应： (1) 对于对照组也出现的一种或数种肿瘤，试验组肿瘤发生率增加； (2) 试验组发生对照组没有的肿瘤类型； (3) 试验组肿瘤发生早于对照组； (4) 与对照组比较，试验组每个动物的平均肿瘤数增加。 在进行试验的两个物种两种性别动物中，有一种结果为阳性，即认为该受试物有致癌性。两个物种两种性别动物试验结果均为阴性时，方能认为未观察到致癌作用。 （二）致突变试验用于致癌物筛选 预测致癌性的理想致突变试验应能灵敏地预测出受试物的致癌性，也能特异地预测出受试物的非致癌性，即要有高的灵敏性和特异性。 灵敏性指受试物在致突变试验中的阳性比例。 特异性指受试物在致突变试验中的阴性比例。用于致癌物筛选的短期试验如下：基因突变试验：鼠伤寒沙门氏菌回复突变试验(Ames试验)，培养哺乳动物细胞TK或HPRT正向突变试验；染色体畸变试验：体外细胞系细胞遗传学分析，小鼠骨髓微核试验，大鼠骨髓染色体畸变试验；原发性DNA损伤：DNA加合物，链断裂，DNA修复诱导(细菌SOS反应，大鼠肝UDS诱导)，SCE试验；体外细胞转化：叙利亚地鼠胚胎细胞，Balbc 3T3细胞。（三）细胞恶性转化试验 是短期试验中的一类重要方法。将受试物在体外与动物细胞株接触，若受试物具有致癌作用，则正常细胞的形态、功能发生变化与癌细胞类似，此种现象称为转化或恶性转化。通过增殖，这些表型变异细胞形成与正常细胞不同的集落，即转化集落。利用这些集落的存在、形成率以及将转化细胞接种于裸鼠中发生肿瘤的情况来评价化学物的致癌活性。 该方法操作快速，理论上可靠。试验证明，细胞恶性转化与Ames试验配套使用，可检出9899的致癌物。而且试验周期短，简便经济，易于观察，灵敏度高，受试物直接作用于靶细胞，便于剂量控制，免受整体动物体内免疫系统和生物转化、生物转运的影响。 但恶性转化大多数属形态转化或恶性前期转化，这种转化可发展为真正的恶性病变，也可能到此为止，并一定形成肿瘤。因此阳性结果只提示受试物具有致癌的可能性。 （四）哺乳动物短期致癌试验 哺乳动物短期致癌试验又称为有限体内试验，指时间有限(数月)，靶器官有限。较受重视的短期致癌试验有下列四种：小鼠皮肤肿瘤诱发试验、小鼠肺瘤诱发试验、大鼠肝转化灶诱发试验、雌性大鼠乳腺癌诱发试验。 （五）人群流行病学研究 流行病学调查是获得环境化学物对人类致癌性的最可靠证据的主要手段，经验证明大多数化学物质的致癌物是依据职业性接触人群的流行病学调查而肯定的。 调查应该包括前瞻性和回顾性调查。重点调查各种肿瘤发生率、死亡率、潜伏期、剂量效应关系以及接触剂量与肿瘤发病率和死亡率的关系。（六）转基因动物致癌检测模型动物致癌试验耗时长，耗费人力物力大，使用的染毒剂量大。转基因底物为快速检测致癌物和促癌物提供了新的重要途径。转基因小鼠可用于研究在致癌过程中特定基因的作用，可用于分析化学物-基因的相互作用。2、肿瘤抑制基因敲除小鼠 将一段DNA整合到肿瘤抑制基因中，使该基因不能表达具有正常功能的蛋白质。1.过量表达癌基因的转基因小鼠 这类转基因动物是研究化学物致癌作用的敏感体系。携带癌基因的转基因动物可用于致癌试验，试验周期仅3个月左右，有希望发展成代替长期动物致癌试验的试验系统。 （七）结构与生物活性关系分析典型的例子是根据分子轨道法提出的多环芳烃致癌的K区理论和湾区理论的等。如果在定量结构-活性关系研究中发现化学物具有某些可引起肿瘤的特殊结构，应考虑进一步的相关试验，或不将其应用于药品及工业生产中。第三节第三节 环境环境化学物化学物的生殖发育毒性的生殖发育毒性 及其及其评价评价 生殖发育过程即繁殖过程，包括：生殖细胞发生 卵细胞受精 着床 胚胎形成 胚胎发育 器官发生 胎仔发育 分娩和哺乳 生殖毒性：对生殖细胞、卵细胞受精、胚胎形成、妊娠、生殖毒性：对生殖细胞、卵细胞受精、胚胎形成、妊娠、分娩和哺乳的损害作用。分娩和哺乳的损害作用。发育毒性：对胚胎发育、胎仔发育及出生幼子发育的损害发育毒性：对胚胎发育、胎仔发育及出生幼子发育的损害作用。作用。一、生殖毒性及评价（一）对雄性生殖系统的毒害作用 包括对睾丸生精细胞的影响、对内分泌功能的影响、对性功能和生殖功能的影响。 精子的生成有赖于下丘脑-垂体-睾丸轴的调节功能。（二）对雌性生殖系统的损害作用 包括对卵细胞和内分泌功能的影响。下丘脑LH-RH垂体前叶FSHLH卵泡初期成长卵泡成熟排卵黄体形成雌二醇孕 酮 （） （） （） （）（三）生殖毒性及其评定 外来化合物对生殖过程作用的评定主要通过生殖毒性试验来进行。可全面反映外来化合物对性腺功能、发育周期、交配行为、受孕、妊娠、分娩、授乳及幼子断奶后生长发育可能产生的影响。1、试验方法原则 材料：性成熟大鼠，或小鼠、家兔 剂量：三组 最高：出现轻度中毒，不死亡或死亡率小于10 等比级数 中：极轻微中毒 低：无中毒症状 染毒方式：口服饲喂法、灌胃法 数量：雌雄各1620只，或雌1620只，雄810只（2）试验方案a、三代两窝试验 近年来许多国家与机构多规定采用两代一窝或一代一窝试验法，两代一窝生殖试验法基本程序与三代两窝试验法相同，但只进行到第二代F2，每代只生育一窝。 （3）观察指标 在上述各种生殖毒性试验中，根据哺乳动物全部生育繁殖过程，可观察下列4个指标：受孕率：反映雌性动物生育能力正常分娩率：反映雌性动物妊娠过程是否受影响幼仔出生存活率：反映雌性动物分娩是否正常幼仔哺育成活率：反映雌性动物授乳哺育幼仔的能力二、发育毒性及评价 胚胎毒性发育毒理学范畴，母体毒性生殖毒理学范畴。都是化学物对生殖繁殖过程的影响，是在不同阶段和不同靶部位的具体体现。（一）胚胎毒性指外来化学物对母体子宫内胚胎或胎儿产生的毒作用。具体表现：1、胚胎死亡2、生长迟缓：平均体重低于正常值两个标准差。3、功能发育不全：包括代谢、免疫、神经系统方面的缺陷。4、畸形：包括外观、内脏、骨骼畸形，指的是器官形态结构的异常，与发育缺陷不同，它指的是出生后个体发育紊乱引起的结构、功能、代谢、精神、行为和遗传等异常。 畸形指的是器官形态结构的异常，与发育缺陷不同，后者指的是出生后个体发育紊乱引起的结构、功能、代谢、精神、行为和遗传等异常。 与变异区别：两者有时难以区分，一般变异不存在生命危险，甚至不影响正常生理功能，而且难以明确变异与接触某种外源化学物的因果关系。常见的变异有内脏左右易位、手指、足趾数目不同。 （二）母体毒性 指外来化合物在一定剂量下，对受孕母体产生的损害作用。具体表现包括体重减轻、出现某些临床症伏、直至死亡。 常见有以下情况：（1）具有胚胎毒性，但无母体毒性出现。（2）出现胚胎毒性的同时也表现母体毒性。（3）不具有特定致畸作用机理，但可破坏母体正常生理稳态，以致对胚胎具有非特异性的影响，并造成畸形。（4）仅具有母体毒性，但不具有致畸作用。（5）在一定剂量下，既不呈现母体毒性，也未见致畸作用。此种情况并不能确定受试物确实不具致畸作用。可能是动物接触的剂量未达到致畸作用的最小有作用剂量，并非真正不具有致畸作用。（三）发育毒性及评定1、致畸试验 检查受试物能否通过妊娠母体引起胚胎畸形的动物试验，可确定受试物是否有致畸作用，诱发何种畸形及出现畸形的主要器官，最大无作用剂量和最小有作用剂量。 （1）动物选择 食性和对受试物代谢过程与人类接近，体型小，驯服，容易饲养和繁殖及价廉，还应特别注意妊娠过程较短、每窝产仔数较多和胎盘构造及厚度与人类接近等特点。 可选用二种哺乳动物，一般首先考虑大鼠，此外可采用小鼠或家兔。大鼠受孕率高，易于得到足够标本数；胎仔大小适中；大鼠对大多数外来化合物代谢过程基本与人类近似。（2）剂量分组预试验：用孕鼠810只，在妊娠1516天内给予受试物，如果出现严重的母体中毒、流产或胚胎大量死亡，将剂量减小，直到找出母体轻度中毒的剂量。最少设3个剂量组，成等比级数关系。另设对照组，阳性对照、阴性对照最高剂量组可以引起母体轻度中毒，即进食量减少、体重减轻、死亡不超过10%中间剂量组母体出现某些极轻微中毒症状最低剂量组不应观察到任何中毒症状（3）交配处理 每日将已确定受孕雌鼠随机分入各剂量组和对照组。 接触受试物的方式与途径应与人体实际接触情况一致，一般多经口给予。也可采用灌胃方式、腹腔注射法。 大鼠和小鼠一般可自受孕后第5天开始给予受试物，每日一次，持续到第15天。试验期间每23天称取母鼠体重。一方面可根据体重增长，随时调整给予受试物的剂量，同时也可观察受孕动物的妊娠情况和胚胎发育情况。（4）胎仔检查 自然分娩前12日将受孕动物处死，剖腹取出子宫及活产胎仔，并另行记录死胎及吸收胎。 活产胎仔取出后，先检查性别，逐只称重，并按窝计算平均体重，然后由下列几方面进行畸形检查：外观畸形肉眼检查，例如露脑；肉眼检查内脏及软组织畸形，例如腭裂；骨骼畸形检查，例如颅顶骨缺损，分叉肋等。畸形检查只限活产胎仔。（5）结果评定主要计算畸胎总数和畸形总数。计算时还要对剂量效应（反应）关系加以分析。常用评价指标：活产幼仔平均畸形出现率、畸胎出现率、母体畸胎出现率2、致畸物体内筛检试验法（C/K法） 对象：受孕小鼠或大鼠 剂量：至少两个剂量组对照组。高剂量组：最小有作用剂量，允许产生明显母体毒性。 妊娠615天内每天接触受试物，记录体重，自然分娩，肉眼查看畸胎，计算出现死胎母鼠百分率、出现吸收胎母鼠百分率和出生第三日存活幼子百分率。此外，还应计算幼子平均体重和出生三日增长的体重，判断是否生长迟缓，若有培养至断奶，观察是否可逆。 特点：简单易行；经济；可作大批量试验处理；可确定生长发育迟缓是否可逆。3、致畸作用和发育毒性体外试验法 包括全胚胎培养、器官培养、细胞培养。特点：节约人力和时间可利用人血清、尿液，直接观察其对人群的作用可理解代谢物的致畸作用及发育毒性 试验条件易控制（1）全胚胎培养法 系将试验动物的全胚胎在一定培养基中进行培养，观察在接触受试物的情况下，是否出现致畸作用及发育毒性。 常选用来自大鼠妊娠910天、小鼠89天后的胚胎，观察指标有胚胎存活力和组织学形态变化。 鸡、鱼、蛙类胚胎也可采用。（2）器官培养法 系将胚胎或胎仔组织、器官或器官一部分在体外培养，观察外源化学物对其发育过程的影响。 一般利用妊娠1011天的鼠类胚胎肢芽进行悬浮培养。培养79天，期间观察细胞的增殖分化，肢芽大小和形状、软骨形成等。（3）细胞培养法 传代细胞和原代细胞都曾用过，根据是致畸物可干扰细胞的正常生长过程。但传代细胞往往失去原有特性，在致畸物作用下，往往只观察到细胞毒性作用。原代细胞没有这样的缺点。常用的原代细胞有大、小鼠和鸟类的肢芽细胞。4、生殖毒性和发育毒性三阶段一代试验法（1）第一阶段：生育力与生殖功能试验 检验化学物对受孕能力和生殖功能的影响。 剂量组：23个对照组 分组：雌性20只，雄性10只，最好有两种哺乳动物。 性成熟雄鼠接触60天后，雌鼠接触14天，再交配。妊娠14天后，将一半受孕鼠杀死。记录黄体数、着床数和吸收胎数，分别计算着床前死亡率和着床后死亡率；另一半受孕鼠继续试验，直至分娩，哺乳结束，幼子出生后观察有无畸形，称重判断有无发育迟缓。（2）第二阶段试验：致畸作用和胚胎毒性评定 每组雌鼠20只在妊娠6至15日接触受试物。自然分娩前1天，处死孕鼠，取出胎仔，称重、鉴定性别并检查内脏和骨骼有无畸形。（3）第三阶段试验：围产期及出生后发育情况试验 妊娠第15天开始接触受试物直至断奶。以评定受试物可能对胎仔发育后期、母体妊娠、分娩和受乳以及幼仔在新生期间存活和生长发育的影响。观察指标有受孕率、幼仔性别比例或雌雄两性各占幼仔总数的百分率、出生存活率、哺育成活率等。 （四）致畸作用的机理 目前已知致畸因素很多，其中主要是化学因素。其机理复杂，至今尚未阐明。1、基因突变和染色体畸变 基因突变：生殖细胞具遗传性，但发生较少。因其不易完成胚胎及胎仔的正常发育过程体细胞即胚胎细胞，非遗传性，表现在子代 染色体畸变：常导致胚胎死亡。不死亡可产生畸形和障碍。2、生物合成的原料和能量不足 指细胞内各种生物合成必需的能量和原料供应不足或代谢过程受到干扰。胚胎组织增殖速度很快，短时间内要消耗大量能量，能量代谢受阻可畸形。3、细胞毒作用 由于致畸物对DNA复制、转录和翻译或细胞分裂等过程的干扰，影响细胞的增殖，即表现出细胞毒作用，引起组织细胞死亡，出生时形成畸形。 致畸物量较低：细胞可死亡，但可被存活细胞的增殖补偿，出生时不形成畸形。 致畸物量较高：细胞大量死亡，使胚胎死亡。 只有在一定范围的机理内，细胞增殖速度下降，不能对受损组织补偿，但不危机生命，导致畸形。 细胞分化过程的某一特定阶段、步骤或环节受到干扰，引起畸形。4 、酶的抑制 在细胞分化、增殖及生长发育过程中，一些重要酶类受抑制或破坏，将影响胚胎正常发育过程，引起畸形。5、对细胞膜的损伤 细胞膜正常结构及渗透性等生物物理性质改变的情况下，也可出现畸形。细胞膜结构的正常与保持渗透压是维持细胞增殖及细胞代谢所必需。6、非特异性发育毒性作用 特点是全部胚胎组织细胞基本生命现象的干扰。与能量代谢有关的环节受到干扰，全部组织受到损害，并引起胚胎全面生长迟缓。不存在靶部位与靶组织，不可能有部分组织受损与畸形幼子出生。7、母体与胎盘的正常功能受到干扰 胚胎的正常发育与母体、胎盘的正常功能有密切关系。8、致畸作用中生物化学作用因素的新认识 近年来细胞通讯和程序性细胞死亡的障碍或干扰及遗传毒性的研究很受重视。