水稻显性矮秆基因特征分析及功能研究

分类号 S511 学 号 2008201008 博士学位论文水稻显性矮秆基因Epi-df的图位克隆、表观修饰特征分析及功能研究张 立 国指导教师万建民 教授专业名称遗 传 学研究方向水稻分子遗传答辩日期二一二年十二月POSITIONAL CLONING, EPIGENETIC MODIFICATION AND FUNCTIONAL ANALYSES OF A DOMINANT DWARF GENE OF Epi-df IN RICE (ORYZA SATIVA L.)ByZhang LiguoA dissertation submitted toNanjing Agricultural University In Partial Fulfillment of the Requirements for Doctoral Degree SupervisedByProfessor Wan JianminDepartment of Crop Genetics and Breeding Nanjing Agricultural University Nanjing 210095, P.R.ChinaDecember 2012原 创 性 声 明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者（需亲笔）签名： 年 月 日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权南京农业大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编学位论文。保密，在 年解密后适用本授权书。本学位论文属于不保密。 （请在以上方框内打“”）学位论文作者（需亲笔）签名： 年 月 日导师（需亲笔）签名： 年 月 日目 录摘 要IABSTRACTIII缩略词V第一章 文献综述11 水稻株高的研究概况11.1 水稻矮化突变体的遗传研究进展11.2 水稻矮化机制的研究进展21.3 水稻显性矮秆突变体的研究进展62 植物表观遗传调控的分子机制72.1 表观遗传学的定义和研究内容72.2 DNA甲基化72.3 组蛋白修饰132.4 表观遗传学的研究方法172.5 表观等位基因的克隆193 PcG蛋白介导的基因沉默与植物发育203.1 PcG蛋白复合体的组成和分类213.2 PcG蛋白与TRX蛋白的相互拮抗223.3 PcG蛋白介导的H3K27me3修饰的建立、维持以及识别233.4 PcG蛋白对植物发育的调控254 本研究的目的和意义27第二章 水稻Epi-df突变体的表型及遗传分析291 材料与方法291.1 实验材料与田间种植291.2 Epi-df降秆能力调查301.3 Epi-df花器官突变、花粉育性以及结实率调查301.4 Epi-df遗传规律和回复突变调查302 结果与分析302.1 Epi-df表型分析302.2 Epi-df花器官变异及育性分析312.3 Epi-df降秆能力分析342.4 Epi-df遗传规律分析343 讨论373.1 Epi-df具有潜在的育种利用价值373.2 Epi-df遗传稳定但存在低频率的回复突变38第三章 水稻显性矮秆基因Epi-df的图位克隆及转基因验证391 材料与方法391.1 实验材料与田间种植391.2 DNA提取401.3 PCR分析401.4 分子标记设计411.5 基因定位411.6 候选基因预测和测序421.7 RNA提取、RT-PCR及Real-time PCR421.8 转基因互补载体的构建421.9 转基因过表达载体的构建431.10 农秆菌介导的遗传转化431.11 转基因阳性植株的鉴定432 结果与分析442.1 初定位和精细定位442.2 候选基因分析452.3 候选基因的测序和表达分析462.4 转基因验证473 讨论493.1 Epi-df突变表型来自FIE1基因的异位表达493.2 FIE1异位表达可能是由表观突变导致的50第四章 水稻FIE1基因的表观遗传修饰及功能分析511 材料与方法521.1 DNA甲基化分析521.2 亚硫酸盐法DNA甲基化测序531.3 染色质免疫共沉淀（ChIP）531.4 生物信息学分析531.5 胚乳RNA提取、RT-PCR及Real-time PCR531.6 印记分析541.7 酵母双杂交分析541.8 Microarray分析552 结果与分析552.1 FIE1基因DNA甲基化分析552.2 FIE1基因位点组蛋白H3K9me2和H3K4me3分析602.3 FIE1基因结构及蛋白同源分析612.4 FIE1基因表达模式分析642.5 FIE1基因印记分析662.6 FIE1蛋白与水稻E（z）类蛋白互作682.7 FIE1基因异位表达对靶基因H3K27me3修饰的影响693 讨论713.1 Epi-df是水稻中发现的第一个DNA去甲基化表观突变体713.2 FIE1的胚乳特异性表达和印记模式受DNA甲基化调控723.3 FIE1蛋白参与PcG蛋白复合体PRC2介导的转录抑制733.4 水稻中PRC2介导的H3K27me3修饰途径受H3K9me2的调控74第五章 全文讨论与结论751 讨论751.1 Epi-df具有自身的表观遗传学特征751.2 表观遗传修饰对水稻两个FIE基因的功能分化起重要作用751.3 水稻H3K27me3的正常功能依赖于H3K9me2对FIE1的转录抑制762 结论762.1 Epi-df是一个降秆能力较强的显性矮秆突变体762.2 Epi-df的表型是由FIE1基因的表观遗传突变导致的762.3 FIE1的表达模式和印记特征受表观遗传修饰调控772.4 FIE1参与PRC2介导的基因沉默783 本文创新之处78参考文献79附 录97在读期间发表的论文109致 谢111水稻显性矮秆基因Epi-df的图位克隆、表观修饰特征分析及功能研究摘 要株高是与产量相关的重要农艺性状，株高超过一定范围容易引起倒伏而减产，矮秆不仅有利于抗倒伏，而且耐贫瘠，有利于提高产量。20世纪50年代末开始的矮化育种，使水稻株高降低至半矮秆，水稻单产获得了第一次飞跃，成为“绿色革命”的标志性成就之一。目前正在进行的超级稻育种主要利用理想株型和籼粳亚种间杂种优势以期水稻单产得到进一步提高。迄今水稻育种中利用的矮秆基因都是隐性基因，杂交水稻育种中隐性矮秆基因的使用往往要求双亲必须具有同一矮秆基因，这就限制了在更广泛的资源中选择有利亲本。但是如果利用显性矮秆基因，则能够使水稻种质资源得到更有效的利用和缩短育种时间。因此发掘新的水稻株高控制基因特别是显性矮秆基因，对进一步提高水稻单产具有重要意义。本研究对显性矮秆突变体Epi-df进行了系统的表型考察和降秆能力分析，并对产生矮化的分子机制进行了深入研究。主要研究结果如下：（1）Epi-df从苗期至成熟期表现矮化，并且与野生型杂交F1表现类似突变体的表型，因此，Epi-df属于显性矮秆突变体。Epi-df与籼稻品种培矮64正反交F1株高介于两者之间，F2代分离群体中高株和矮株数比例接近1：3，表明Epi-df表型是由单显性核基因控制。将Epi-df与3个籼稻品种和3个粳稻品种杂交，降秆率介于16.3%至50.4%之间，表明Epi-df具有较强的降秆能力，有望在水稻籼粳交杂种优势利用育种中得到应用。（2）利用图位克隆方法将突变基因精细定位在49kb区域内，但并未发现DNA序列突变，却发现其中的ORF5在突变体中表达强烈，而在野生型中沉默。Epi-df还存在另外一个特征，即虽然表现遗传稳定但存在低水平的回复突变频率，因此ORF5的异位表达可能是由表观遗传变异引起的。DNA甲基化测序结果表明FIE15端发生了DNA去甲基化，这与FIE1的异位表达是一致的。尽管FIE1在回复突变株中保持沉默，但DNA甲基化并未恢复到野生型水平，发生恢复的位点主要集中在转录起始点附近和第3个外显子。另外，Epi-df中FIE15端H3K9me2水平下降，而H3K4me3水平上升，这与FIE1基因的异位表达和DNA去甲基化是一致的。因此，Epi-df是一个表观遗传突变体，这为研究表观遗传修饰对单子叶植物尤其是重要作物的生长发育的调控提供了重要材料。（3）FIE1是胚乳特异性表达的基因，并且具有仅母本表达的印记特征。FIE1在叶片、茎和幼穗中存在高水平的DNA甲基化，而在受精后第6、9和12天的胚乳中甲基化水平严重降低，并且F1胚乳中母本FIE1的DNA甲基化水平比父本低很多，因此FIE1的表达模式和印记特征受DNA甲基化调控。与拟南芥仅有一个FIE基因不同，水稻含有两个FIE基因，另一个FIE基因FIE2是组成性表达的，因此我们推测水稻基因组复制以及随后的进化过程中，表观遗传修饰对两个FIE基因的功能分化起了重要作用。（4）酵母双杂交结果表明FIE1与iEZ1以及CLF互作，表明FIE1参与水稻中PRC2介导的转录抑制。基因芯片分析发现Epi-df中有305个基因的表达发生了改变，其中222个基因下调，83个基因上调。利用染色质免疫共沉淀技术发现这些表达量改变的基因同时伴随着H3K27me3修饰的改变。因此，FIE1的异位表达导致靶基因H3K27me3修饰水平和表达量的改变，从而使Epi-df表现突变表型。（5）H3K9me2和H3K27me3是与转录抑制相关非常保守的两种表观遗传修饰， H3K9me2主要集中在异染色质，起抑制转座子和逆转座子转录和转座的功能；H3K27me3基本存在于常染色质，起抑制基因转录和维持细胞记忆的功能。染色质免疫共沉淀分析表明FIE15端存在高水平的H3K9me2，而Epi-df中H3K9me2水平降低引起FIE1异位表达和基因组水平上H3K27me3分布异常，从而导致水稻发育缺陷。因此，H3K9me2控制的FIE1转录抑制对水稻中H3K27me3的正常功能是必需的。关键词：水稻；显性矮化；FIE1；表观遗传突变；H3K9me2；H3K27me3POSITIONAL CLONING, EPIGENETIC MODIFICATION AND FUNCTIONAL ANALYSES OF A DOMINANT DWARF GENE OF Epi-df IN RICE (ORYZA SATIVA L.)ABSTRACTPlant height is an agronomically important trait for grain yield，the higher plant is easy to be lodging and decreasing yield, whereas dwarf plant has a great harvest index because of improved lodging resistance and increasing use of nitrogen fertilizers. Dwarfism breeding resulted in the first qualitative leap for yield increase, which was well known as “green revolution”. The objective of super rice breeding is to make a breakthrough in rice yield by using ideotype and inter-subspecific heterosis. Whereas all the dwarf genes used in rice breeding is recessive by now, thus both the male and female parents must carry the same recessive dwarf gene in hybrid rice breeding process. But when one parent carries a dominant dwarf allele, the germplasm of the other parent would not be restricted. Therefore, isolation new genes that control plant height especially the dominant dwarf genes is crucial for improving rice yield. In this study, we systematacially characterized a dominant dwarf mutant Epi-df and analyzed the molecular mechanism for dwarfism.The main results as follows:(1) From seedling to mature stage, Epi-df showes dwarf phenotype. When crossed with WT, the F1 plants show the phenotype similar to Epi-df, thus, Epi-df is a dominant dwarf mutant. When crossed with PA64, the plant height of F1 is between two parents, and the ratio of normal to dwarf plants in F2 population is nearly to 1:3, suggesting that the mutant phenotype is controlled by one dominant nuclear gene. When Epi-df was crossed with three indica varieties and three japonica varieties respectively, the plant height reduction is from16.3 to 50.4%, suggesting the strong plant height reduction ability. Thus, Epi-df may be used for rice inter-subspecific heterosis breeding in the future.(2) The mutative gene was fine mapped within a 49kb region, whereas there was no nucleotide mutation. However, we found ORF5 (one of the seven ORFs within the mapping region) was ectopically expressed in Epi-df, but silenced in WT. Considered the revertants emerged from Epi-df population, we speculated that Epi-df was an epigenetic mutant. By using bisulfite sequencing, we found DNA hypo-methylation was occurred at 5 region of FIE1. We also analyzed the methylation patterns of six revertants and found even FIE1 was silenced in them, DNA methylation was not recovered to the WT level, the recovered sits were enriched around the transcriptional starting site and within the third exon. We also found there were reduced H3K9me2 and increased H3K4me3 at the 5 region of FIE1. Thus, Epi-df is an unexpected epigenetic mutant, which would like to provide an intriguing opportunity to unravel epigenetic modifications for development regulation in important crop plants.(3) We discovered that FIE1 was a maternal-specific expressing gene in endosperm, which was coincided with the methylation pattern of FIE1 in tissues. The methylation level is higher in leaf, culm and young panicle than that in endosperm 6, 9 and 12 days after pollination. We also found the methylation of maternal FIE1 was much lower than that of paternal. If Epi-df was used as pollen donator, the imprinting pattern was disturbed, and the methylation levels of both parental were lower. Unlike Arabidopsis, which contains only one ubiquitously expressed FIE gene, there are two FIE gene in rice, the other gene FIE2 is expressed in all the tissues. We conclude that during the genome duplication and the latter evolution, epigenetic marks may play an important role in the differentiation of the two FIE gene in rice.(4) Yeast two-hybrid assay showed FIE1 interacted with rice E(z) homologs, suggesting FIE1 participates in PRC2 repression which catalyzes H3K27me3 at targets. Microarray analysis showed 305 genes were misregulated in Epi-df accompanied with changed H3K27me3 levels. Thus, ectopic expression of FIE1 resulted in the mutant phenotype via abnormal distribution of H3K27me3. (5) H3K9me2 and H3K27me3 are two conserved repressive epigenetic marks in both animal and higher plants. H3K9me2 is mainly enriched in heterochromatin and functions in suppressing transposons, while H3K27me3 is mainly localized in euchromatin and provides a cellular memory to maintain the repressive state of target genes. We found there was high level of H3K9me2 at 5 region of FIE1, whereas in Epi-df, H3K9me2 was reduced and resulted in ectopic expression of FIE1 and abnormal distribution of H3K27me3. We conclude that silencing of FIE1 via H3K9me2 is essential for normal function of H3K27me3 in rice. KEY WORDS: Rice; Dominant dwarf; FIE1; Epigenetic mutation; H3K9me2; H3K4me3缩 略 词Abbreviations英文缩写English abbreviations英文名称English name中文名称Chinese nameBERBase excision repair碱基切除修复机制ChIPChromatin Immunoprecipitation染色质免疫共沉淀DMRsDNA demethylation regionsDNA去甲基化区域DSBsDouble-strand breaks双链缺口FIEFertilization independent endosperm 不依赖受精的胚乳HATsHistone acetyltransferases组蛋白乙酰转移酶HDACsHistone deacetylases组蛋白去乙酰化酶HKMTsProtein lysine methyltransferases组蛋白赖氨酸甲基转移酶H2Aub1H2A monoubiquitionation组蛋白H2A单泛素化H3K4me3Histone3 lysine4 tri-methylaiton组蛋白H3赖氨酸4三甲基化H3K9me2Histone3 lysine9 di-methylaiton组蛋白H3赖氨酸9二甲基化H3K27me3Histone3 lysine27 tri-methylaiton组蛋白H3赖氨酸27三甲基化MSAPMethylation-sensitice amplified polymorphism甲基化敏感扩增多态性PcGPolycomb group聚梳类（蛋白）PRC2Polycomb Repressive Complex 2PcG抑制复合体2PREsPolycomb response elementsPRC2反应元件PRMTsProtein arginine methyltransferases精氨酸甲基转移酶RdDMRNA-directed DNA methylationRNA介导的DNA甲基化TGSTranscriptional gene silencing转录水平上的基因沉默UBPsUbiquitin proteases泛素蛋白酶第一章 文献综述随着人口数量的日益增加和可利用耕地面积的不断减少，提高粮食单产，已成为确保我国粮食安全的最重要途径。水稻是我国最重要的粮食作物之一，在保障我国粮食安全中始终担当着重要角色。建国以来我国的水稻单产经历了两次质的飞跃，第一次是20世纪50年代末60世纪初以半矮秆基因sd-1的利用为标志的“绿色革命”，使高秆水稻品种变为抗倒伏的半矮秆品种，水稻单产提高了20-30%(Peng等，1999)；第二次是70年代三系配套的成功使水稻杂种优势得以有效利用，水稻单产又在矮秆品种的产量基础上提高了20%（程式华，2000）。矮秆资源的合理利用是水稻株型改良的基础,是两次单产突破的关键。然而进入80年代末和90年代初，我国水稻单产进入徘徊状态，如何进一步提高杂交水稻的单产是目前最为紧迫的任务。水稻籼粳亚种间F1代表现强大的杂种优势，是进一步提高水稻单产的有效途径。然而籼粳亚种间杂种表现株高偏高，生育期超亲晚熟以及结实率偏低限制了籼粳杂种优势的利用(杨守仁等,1982)。因此，发掘能有效降秆并抑制F1株高超亲优势，且对其它重要农艺性状影响较小的显性矮秆基因，对水稻籼粳杂种优势利用和进一步提高产量具有重要意义。表观遗传调控是基因表达调控的重要组成部分，已成为当前研究的热点。经典遗传学指出,基因结构的改变会引起生物体表现型的改变,这种改变可以从上一代传递到下一代。然而生物体从祖先基因组中所获得的并不仅仅是基因序列。在基因序列不发生变化的条件下，基因表达发生的改变也可以是遗传的，导致可遗传的表现型变异。这种可遗传的表现型变化没有直接涉及到基因序列的改变，因而是表观的，称之为表观遗传变异(Holliday, 1987; Wu等, 2001; Holliday, 2006)。研究表观遗传变异的遗传学称之为表观遗传学。水稻作为重要的粮食作物和模式植物，许多生物过程受表观遗传调控，因此在水稻中开展表观遗传学研究具有重要的理论和现实意义。1 水稻株高的研究概况1.1 水稻矮化突变体的遗传研究进展传统水稻品种一般为高秆，矮化是水稻的突变性状。高秆品种易倒伏，利用价值不高，矮秆水稻品种因具有较高的利用价值而研究较多。根据株高矮化的程度，广义的矮秆又分为半矮秆、矮秆和极矮秆3种类型。狭义的矮秆通常指成熟时株高等于或低于原正常株高一半的类型；半矮秆是指株高介于矮秆和正常株高之间的矮秆类型。水稻植株矮化是由节间缩短或节间数目减少导致的，也有可能是两者共同作用的结果。Takedea(1977)以节间长度占株高的比例为指数将矮秆分为dn、dm、dg、nl和sh五种类型，将节间比例正常的品种定为N型。dn类型的特征是各节间比例与N型类似；dg类型的特点是第二节间缩短；nl类型的特征是有茎叶，第一节间缩短而第四节间伸长，偶尔有第六节间伸长；dm类型的特征是第二节间特别短；sh类型的特征是第一节几乎不伸长，穗部包在剑叶叶鞘中。除dn类型外，其余类型都存在某一特定节间的缩短，这表明不同矮化基因作用于不同的节间伸长。水稻矮秆遗传主要有两种类型：一类是由单基因控制的质量性状遗传，另一类是由多基因控制的数量性状遗传。生产上利用的籼稻主要矮源大部分是隐性单基因遗传，并且与sd-1等位。与籼稻相比，粳稻的矮化遗传要复杂的多，根据控制矮化的基因对数分为两类：一类是受单个矮秆主效基因控制，并且这些主效基因大多不等位；另一类是受多个微效矮秆基因控制。Parnell等（1922）报道了1个由隐性单基因控制的自然矮秆突变体,这是有关水稻矮生性遗传的最早报道。自上世纪六十年代以来,伴随着水稻矮化育种的发展,新发现的水稻矮秆基因不断增加。卢永根等（1979）和顾铭洪等（1988）对我国籼稻品种的矮生性遗传作了系统性研究，发现我国籼稻中存在的矮秆基因有四个：sd-1、sd-g、sd-n(t)和sd-t(t)。目前我国生产上籼稻利用的矮源主要来自矮脚南特、矮仔占、低脚乌尖、花龙水田谷和矮种水田谷,它们均受1对隐性基因sd-1控制。Monna等（2002）利用图位克隆分离出sd-1基因，发现它编码赤霉素合成途径的一个关键酶：赤霉素20-氧化酶。梁国华等（2004）利用新桂矮双矮和02428杂交产生的F2代分离群体，将sd-g精细定为于第5染色体约85kb的区域内。李欣等（2001，2002）通过遗传分析发现sd-t（t）和sd-n（t）分别位于第4、5染色体。江光怀（2002）利用矮泰引2号和无叶舌标记基因系B30为材料,将sd-t(t)基因定位在水稻第4染色体约147kb的范围内。1.2 水稻矮化机制的研究进展1.2.1 水稻矮化与植物内源激素的关系矮秆基因能直接导致水稻植株形态学变化，如细胞长度变短和细胞数目减少，从而引起植株节间变短和植株变矮。目前克隆的水稻矮秆基因大多涉及到激素代谢和信号传导，表明植物内源激素对水稻株高具有重要的调节作用。植物激素都是简单的小分子有机化合物，但它们的生理效应却非常复杂，可以影响植物细胞的分裂、伸长以及分化，从而影响植物株高以及其它生理过程。随着气相色谱-质谱联用技术(GC-MS)和同位素示踪技术的应用, 对植物内源激素的种类、结构、合成途径和信号传导等获得了较深入的了解。近年来植物分子遗传学的发展,使植物激素对植物生理影响的研究逐步深入到分子水平。根据植物矮化突变体对外源激素的反应,可将其分为缺陷型和不敏感型两类。缺陷型矮化突变体的活性激素生物合成途径被抑制或阻断，使得植物内源活性激素缺乏或痕量存在，体外施用相应的活性激素后可使突变体的矮化表型得以恢复；激素不敏感型矮化突变体的内源活性激素水平变化不大，甚至比野生型的还高,这类突变体在体外施用相应的活性激素后不能恢复野生型表型，这可能是在激素信号传导过程中出现障碍。目前有关植物激素对株高影响研究最多的是赤霉素（GA）和油菜素内酯（BR）这两大类激素，对它们合成代谢的研究已经较为成熟，而信号传导的研究还并不完善。1.2.2 水稻矮秆基因的克隆及功能研究迄今为止已获得了超过70个水稻矮化突变体，并且许多矮化基因已被定位或克隆。在这些已被克隆的基因中，大多涉及到赤霉素或油菜素内酯的代谢或信号传导，表明这两类植物内源激素在水稻株高调控中起主导作用。赤霉素是广泛存在的一大类植物激素的总称，其化学结构都属于二萜类酸，由四环骨架衍生而来。它能调节植物生长发育的许多过程，例如种子萌发、节间伸长、叶片伸展、开花以及果实发育等(Olszewski等, 2002)。上个世纪60年代在水稻和小麦中进行的利用与赤霉素相关半矮秆突变体进行的矮化育种大幅提高了粮食产量，被称为“绿色革命”(Peng等, 1999)。在“绿色革命”中广泛应用的水稻半矮秆基因sd-1就是GA-20氧化酶（GA20ox2）编码基因。在sd-1突变体中，赤霉素合成的前体物质GA53显著增加，而有活性的GA20和GA1减少 (Monna等, 2002; Sasaki等, 2002; Spielmeyer等, 2002)。水稻基因组中存在两个GA20ox基因：GA20ox1和GA20ox2。GA20ox2对应于sd-1位点，它在叶片、节间和已开放的花中表达强烈，而GA20ox1主要在未开放的花中表达。研究表明GA20ox1与sd-1的表型无关，但它在未开放的花中表达，因此在GA20ox2突变的情况下可以维持赤霉素在花中的浓度，使水稻的育性不受影响。eui(elongated uppermost internode)突变体在水稻杂交制种过程中得到广泛利用，它能使不育系的第一节间伸长从而使穗部从剑叶叶鞘中伸出，从而接受恢复系的花粉。EUI编码一种细胞色素P450，主要在节间分裂旺盛的区域表达，它能使有活性的GA4通过16a，17-脱羟基反应而失活。EUI突变后有活性的GA4和GA1水平升高，使最上节间细胞分裂旺盛从而伸长(Zhu等, 2006)。上世纪50年代日本育种人员利用半矮秆品种Tan-Ginbozu育成的水稻新品种大幅提高了产量。Tan-Ginbozu含有d35基因，并且研究认为d35可能参与赤霉素合成的前期阶段。Itoh等（2004）克隆了D35基因，发现它编码贝克衫烯氧化酶（ent-kaurene oxidase，KO），并且与拟南芥和南瓜的贝克杉烯氧化酶高度同源。Sakamoto等（2004）利用其它物种中已知的赤霉素合成酶基因，从水稻基因组数据库中分离了水稻赤霉素合成途径中的29个候选同源基因。通过比较发现与拟南芥中单个的赤霉素合成酶基因不同，水稻中的柯巴基焦磷酸合成酶（ent-copalyl diphosphate synthase，CPS）基因，贝壳杉烯合成酶（ent-kaurene synthase，KS）基因以及贝壳杉烯氧化酶（ent-kaurene oxidase，KO）基因分别存在多个同源基因，并且这些同源基因都分布在连续的某个区域。作者还鉴定了18个赤霉素合成缺陷型突变体并发现分别属于6个不同的等位基因。通过研究发现赤霉素合成途径前期所需的催化酶如CPS、KS、KO以及KAO是由单基因编码的，而后期所需酶类如GA20ox、GA3ox和GA2ox是由多基因编码的。剩余的CPS、KS以及KO类似蛋白则可能与赤霉素合成无关，可能涉及到抗逆相关的二萜类植物抗毒素的合成。水稻中最早发现的赤霉素不敏感突变体是dwarf1，表现矮化、叶宽且深绿、花序紧凑和小粒等表型。图位克隆后发现DWARF1编码GTP结合蛋白a亚基(Ashikari等, 1999)。由于dwarf1表现对赤霉素不敏感，推测GTP结合蛋白可能在赤霉素信号传导过程中起作用(Ueguchi-Tanaka等, 2000)。拟南芥中的GAI(Gibberllin-insensitive)是赤霉素响应的负调控因子，突变后使拟南芥矮化(Peng等, 1997)。小麦和玉米中的GAI同源基因分别是Rht和D8，在上世纪60年代进行的矮化育种中对提高产量起了重要作用，与sd-1同时被称为“绿色革命基因”(Peng等, 1999)。水稻中的GAI同源基因是SLR1，slr1(slender rice1)突变体植株苗期细长,并且对赤霉素反应不敏感。SLR1编码DELLA结构域蛋白，DELLA结构域在赤霉素信号转导中对赤霉素的响应非常重要(Ikeda等, 2001)。对不敏感突变体gid2(gibberellin insensitive dwarf2)的分析表明GID2编码一个SCF E3泛素连接酶复合体中的F-box亚基。GID2是赤霉素响应的正调控因子，它能在赤霉素存在的情况下结合SLR1，从而引导其通过SCFGID2蛋白酶体途径降解(Gomi等, 2004)。对另外一个赤霉素不敏感突变体gid1(gibberellin insensitive dwarf1)分析发现，GID1能够结合有生物活性的赤霉素，并且这种结合能够促进GID1和SLR1的结合，从而激活SCFGID2蛋白酶体途径降解SLR1。这些结果表明GID1可能是赤霉素受体(Ueguchi-Tanaka等, 2005; Hartweck等, 2006)。除此之外，赤霉素信号传导途径的其它组分和DELLA蛋白的其它功能还未知。油菜素内酯（Brassinosteroid, BR）是植物中最早发现的一类甾醇类植物内源生长促进激素，20世纪70年代从油菜的花粉中首次分离到(Mitchell等, 1970)。BR在植物组织中含量很低，但对生长发育起重要作用。现已证明BR在植物的种子休眠与萌发、器官分化、维管组织发育、开花和衰老以及向性建成等过程中起重要调控作用(Yamamoto等, 1997; Bishop等, 2001; Yamamoto等, 2001)。brd1(brassinosteriod-deficient dwarf1)是水稻中发现的第一个BR缺陷型突变体，它最显著的特征是节间伸长严重受阻、叶鞘缩短、叶片短而卷曲、分蘖减少以及不育。施加外源BR后能恢复表型，因此推断brd1突变体中BR合成受阻。BRD1编码一个BR C-6氧化酶（OsBR6ox），突变后导致有生物活性的BR如油菜素甾酮（Castasterone）、香蒲甾醇（Typhasterol）以及茶甾酮（Teasterone）减少，从而导致矮化等表型(Hong等, 2002)。d2(dwarf2)是发现的另外一种BR缺陷型突变体，株高为野生型的70-80%，第二节间缩短，叶倾角变小。施加外源BR后突变表型得到恢复。D2编码细胞色素P450家族的一个新成员CYP90D2，催化从6-脱氧茶甾酮（6-deoxoteasterone）到3-脱氢-6-脱氧茶甾酮（3-dehydro-6-deoxoteasterone）和茶甾酮（teasterone）到3-脱氢茶甾酮（3-dehydroteasterone）的反应，在BR合成途径的后期起作用(Hong等, 2003)。d11(dwarf11)表现出矮化和种子变短突变表型，施加外源BR能恢复野生型表型，证明D11在BR合成途径中起作用。D11编码一个新的细胞色素P450（CYP724B1），推测可能在6-脱氧香蒲甾醇(6-deoxo-Typhasterol)和香蒲甾醇(Typhasterol)合成中起作用(Tanabe等, 2005)。brd2(BR-deficient dwarf2)突变体在营养生长前期并未表现出明显表型，而在生长后期表现出明显BR缺陷表型，抽穗后株高仅相当于野生型的40%。BRD2编码拟南芥的同源蛋白DIM/DWF1，催化从24-亚甲基胆固醇（24-methylenecholesterol）到油菜甾醇（campesterol）这一过程(Hong等, 2005)。OsDWARF4与D11存在功能冗余，共同作用于C-22羟基化反应。Tos17插入突变体osdwarf4仅表现出叶倾角变小和叶片上举表型，而叶片、花以及粒型都正常，在BR合成方面仅有轻微影响。Tanaka等（2006）发现在密植但不施加更多肥料的情况下，osdwarf4能提高产量(Sakamoto等, 2006)。Sakamoto等（2006）利用同源克隆的方法发现水稻中存在两个拟南芥CYP90A1/CPD的同源基因：CYP90A3/OsCPD1和CYP90A4/OsCPD2，它们催化BR合成中的C-23a羟基化反应。Tos17插入突变体oscpd1-1并未表现出BR缺陷型表型，作者推测它们之间存在功能冗余。BR信号传导相关突变体同样表现出BR缺陷型类似的表型，但施加外源BR不能使表型恢复。水稻中发现的第一个BR不敏感型突变体是d61,它对BR的反应没有野生型敏感。图位克隆后发现D61与拟南芥BRI1同源，编码BR受体激酶OsBRI1(Brassinosteriod insensitive1)(Yamamuro等, 2000)。Bai等（2007）依据序列比对发现拟南芥BZR1(Brassinazole resistant1)在水稻中含有4个同源蛋白，其中OsBZR1与BZR1同源性最高。OsBZR1的RNAi植株表现出矮化、直立叶、BR敏感性降低和BR响应基因表达等表型，表明OsBZR1在水稻BR信号传导中起重要作用。酵母双杂交结果表明14-3-3蛋白与OsBZR1互作。OsBZR1蛋白序列中与14-3-3蛋白互作的位点突变后，导致OsBZR1体内或体外都无法与14-3-3蛋白互作，并且这种突变后的OsBZR1在拟南芥中表达后能抑制bri1-5的突变表型，表明14-3-3蛋白与OsBZR1互作能阻止OsBZR1进入核内，从而抑制OsBZR1的功能(Bai等, 2007)。Tanaka等（2009）发现过表达BU1(BRASSINOSTEROID UPREGULATED1)基因能使水稻叶倾角变大、籽粒变大和增加对BR抑制剂油菜素唑（Brassinazole，Brz）的抗性。BU1的干扰植株则表现出叶倾角变小。在BU1过表达植株中有活性的油菜素甾酮及前体物质并没有增加，表明BU1是作为BR信号通路的正调控因子起作用的。Tong等（2009）发现一个矮化少蘖突变体dlt(dwarf and low tillering)，DLT编码一个植物特有的GRAS家族蛋白，并且OsBZR1蛋白能结合到DLT的启动子，这与DLT对BR处理的负反馈调控机制相一致。张等（2009）在水稻T-DNA插入突变体中发现一个叶倾角增大突变体ili1-D(increased lamina joint inclination)，该表型与过量施加BR后的表型类似。突变表型是由于T-DNA插入位点附近的一个HLH蛋白编码基因过表达造成的。ILI1能够与一个碱性螺旋-转角-螺旋蛋白IBH1互作，过表达IBH1能导致水稻叶倾角增大,而过表达ILI1能抑制过表达IBH1引起的矮化。因此，ILI1能够通过与IBH1形成异源二聚体从而抑制IBH1的功能。1.3 水稻显性矮秆突变体的研究进展杂种优势的利用是增加水稻生物学产量的有效途径之一,特别是籼粳亚种间杂种优势的利用可以大幅度提高产量(袁隆平, 2008)。然而F1代株高超亲成为亚种间杂种优势利用的一个瓶颈。在杂交水稻育种过程中，为了防止F1株高过高，两个亲本必须同时含有同一个隐性矮秆基因，从而排除了在数量更大、遗传基础更为多样的中、高秆水稻品种里寻找杂交稻亲本的可能性。而显性矮秆基因的利用可以解决这个问题,同时在一定程度上也弥补了隐性矮秆基因单一化带来的品种遗传背景狭窄的问题。目前发现的矮秆性状多为隐性基因控制，而由显性基因控制的矮秆或半矮秆性状仅有少量报道（表1-1）。Iwata等（1977）通过射线诱变农林8号得到的D53是最早报道的显性半矮秆突变体。Wei等（2006）将D53基因定位于第11染色体短臂末端。显性半矮秆突变体Y98149是从离子束诱变品种后代中得到的，与野生型相比仅存在株高差异，其它农艺性状基本一致(刘斌美等, 2004)。Y98149携带的显性半矮秆基因目前已被定位到第6染色体短臂约6.4cM的遗传区域内(程灿等, 2006; 刘斌美等, 2006)。王歆等（2008）从水稻T-DNA插入突变体库中筛选到一份显性矮秆突变体，遗传分析表明矮化表型受一对显性单基因控制，并将其定位在第四染色体。Asano等（2009）从N-甲基-N亚硝基脲（MNU）诱变的突变体库中筛选到三个半显性矮秆突变体Slr1-d，图位克隆后发现均来自DELLA蛋白SLR1的功能获得性突变。突变体中SLR1蛋白的降解受阻而积累，并且影响了SLR1与赤霉素受体GID1的互作(Asano等, 2009)。Tid1-1(Twisted dwarf 1-1)是从台春65的MNU诱变突变体库中筛选到一个显性矮化并且右旋性螺旋生长的突变体，图位克隆后发现TID1编码一种微管蛋白-tublin(Sunohara等, 2009)。表1-1 已报道的显性矮秆或半矮秆基因Table 1-1 The reported dominant dwarf or semi-dwarf genes基因Gene表型Phenotype染色体Chromosome参考文献ReferencesD53半矮化、多蘖、节间较细、小穗11Iwata等（1977）；朱立宏等（1995）；Wei等（2006）Sdd(t)半矮化、对赤霉素敏感6刘斌美等(2006)；Liu等(2008)GN42矮化，其它表型影响较小4王歆等(2008)Slr1-d矮化，叶宽且深绿3Asano等(2009)Tid1矮化，叶片和茎右旋形生长11Sunohara等(2009)2 植物表观遗传调控的分子机制2.1 表观遗传学的定义和研究内容表观遗传学（epigenetics）是研究表观遗传变异的遗传学分支学科。表观遗传变异是指在基因序列没有发生改变的情况下,基因功能发生了可遗传的变化,并最终导致表型的变化 (Haig, 2004)。2010年Science上发表的表观遗传学专题认为表观遗传应符合三个特征：可遗传、能自我复制和可逆(Riddihough等, 2010)。研究表观遗传变异的学科就称为表观遗传学。表观遗传主要通过DNA甲基化、组蛋白修饰、染色质重塑和非编码RNA调控等方式控制基因表达。因此表观遗传学研究的内容从广义上来讲包括:DNA甲基化、组蛋白修饰、基因沉默、RNAi、基因组印记、染色质重塑、RNA剪接与编辑、蛋白质剪接与翻译后修饰、X染色体失活以及副突变等。其中DNA甲基化和组蛋白修饰在表观遗传学研究中起主导作用。2.2 DNA甲基化DNA甲基化是一种在进化上非常保守的控制基因沉默的表观修饰方式，DNA甲基化现象广泛存在于细菌、植物和哺乳动物中,是DNA的一种天然的修饰方式，这种修饰对生物体的发育非常重要(Colot等, 1999)。哺乳动物DNA甲基化的缺陷会导致胚胎死亡，而植物中DNA甲基化缺陷虽然不致死，但常常会导致多种形态上的突变。哺乳动物中的DNA甲基化主要发生在对称性的CG位点的胞嘧啶上，并且基因组中70-80%的CG位点的胞嘧啶存在甲基化修饰(Ehrlich等, 1982)。而植物中的DNA甲基化可以发生在所有类型的胞嘧啶上，包括对称性的CG和CHG以及非对称性的CHH（H代表A，T，或C）(Henderson等, 2007)。在拟南芥基因组中，24%的CG，6.7%的CHG和1.7%的CHH被甲基化(Cokus等, 2008)。从产生的方式来看，DNA甲基化分为从头合成甲基化和维持型甲基化，DNA去甲基化分为主动去甲基化和被动去甲基化。2.2.1 从头合成DNA甲基化从头合成DNA甲基化是指RNA介导的DNA甲基化（图1-1）。拟南芥基因组中DNA甲基化主要集中在着丝粒和其它重复序列(Zhang等, 2006; Zilberman等, 2007)。这些甲基化的位点往往伴随着siRNA的产生,大约三分之一甲基化的DNA序列能检测到siRNA，这表明siRNA在DNA甲基化中起重要的作用(Zh