生物化学：第05章 蛋白质III：蛋白质的性质、分离与鉴定第02节

第二节 蛋白质的分离纯化 一、蛋白质分离提纯的一般原则高纯度、高活性、高回收率二、蛋白质的分离方法1.透析（dialysis）和超滤（ultrafiltration）半透膜 （玻璃纸，火棉纸） 透析常用于蛋白质溶液的除盐超滤常用于蛋白质溶液的除盐、浓缩（一）根据分子大小不同的分离方法2. 密度梯度离心（density gradient ultracentrifugation）常见有蔗糖密度梯度（连续、不连续）质量和密度大的蛋白质分子沉降快3.凝胶过滤（gel filtration chromatography） 分子筛层析，分子排阻层析Sephadex G-50 分离范围：1 500-30 000交联葡聚糖交联葡聚糖 （Sephadex）聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶 （Bio-Gel P）琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶 （Sepharose，Bio-Gel A）凝胶过滤原理根据蛋白质分子大小用凝胶作为介质分离蛋白质的一种柱层析方法。比凝胶网孔大的分子被排阻在凝胶颗粒外，而最先流出柱外；比网孔小的分子能不同程度的自由出入凝胶颗粒的内外，洗脱路径长，因而得到分离。（二）利用溶解度差别的分离方法1. 等电点沉淀2. 蛋白质的盐溶与盐析3. 有机溶剂分离法4. 温度对蛋白质溶解度的影响（三）根据电荷不同的分离方法1 电泳（electrophoresis）在一定的电场和介质中，蛋白质迁移速度与蛋白质分子量、所带电荷及分子形状有关。迁移率迁移率某一蛋白条带移动距离/前沿到达距离a. 聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）丙烯酰胺 和 交联试剂（甲叉双丙烯酰胺）在过硫酸铵催化下聚合而成。可以控制孔径大小b. 不连续电泳（不连续电泳（discontinuous electrophoresis） 凝胶孔径（浓缩胶，分离胶）、缓冲液、pH 三种效应：电荷效应、分子筛效应、浓缩效应c. 毛细管电泳毛细管电泳（capillary electrophoresis） 50 m内径d. 等电聚焦电泳（IFE）蛋白质在具有pH梯度的介质中进行分离。在电场中，每种蛋白质成分将移向并停留在等于其等电点的pH处，形成一个很窄的区带。用途：按等电点分离蛋白质 鉴定蛋白质等电点双向电泳双向电泳2. 离子交换柱层析（ion-exchange chromatography）纤维素离子交换剂阳离子交换剂: CM-Cellulose(羧甲基纤维素)葡聚糖离子交换剂（Sephadex ion exchanger） 兼分子筛效应阴离子交换剂: DEAE-Cellulose（四）根据蛋白质的吸附特性分离填料有：羟基磷灰石、活性碳、 硅胶、氧化铝等（五）利用特异生物学亲和力纯化利用蛋白质所具有的生物学特异性，通过与特异配基专一、可逆结合（非共价结合）分离蛋白质的一种层析方法。优点：高效、高纯 亲和层析（afinity chromatography）快速蛋白液相层析fast protein liguid chromatography(FPLC)思考题蛋白质胶体稳定性的原因凝胶过滤、离子交换柱层析的原理电泳原理亲和层析、盐析蛋白质分离可分别根据蛋白质分离可分别根据其其 、 、 、 性质性质进行。进行。蛋白质在电泳胶上的迁移率与蛋白质分蛋白质在电泳胶上的迁移率与蛋白质分子子 、 和和 有关。有关。不连续电泳分离效果好是因为它同时具不连续电泳分离效果好是因为它同时具有有 、 、 三个效应。三个效应。DEAE-cellulose 是一种是一种 。蛋白质混合物经凝胶过滤后，大分子蛋白质混合物经凝胶过滤后，大分子先于小分子被洗脱。（）先于小分子被洗脱。（）盐析和透析均可用于蛋白质除盐。（）盐析和透析均可用于蛋白质除盐。（）羧甲基纤维素属于阳离子交换剂。（）羧甲基纤维素属于阳离子交换剂。（）