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气相液相色谱技术及应用昆虫生理毒理组昆虫生理毒理组气相液相色谱技术及应用气相液相色谱技术及应用气相液相色谱技术及应用l色谱法(色谱法(chromatography)是)是20世纪初世纪初由俄国植物学家由俄国植物学家Tswett发明并命名的发明并命名的 1903年,他做了一个著名的实验,把干年,他做了一个著名的实验,把干燥的叶用石油醚萃取后,将少量的萃取燥的叶用石油醚萃取后,将少量的萃取液倾入填充有沉降液倾入填充有沉降CaCO3的直立玻璃管的直立玻璃管柱的顶端,然后用石油醚洗脱,发现叶柱的顶端,然后用石油醚洗脱,发现叶中的色素在中的色素在CaCO3柱上互相分离,形成柱上互相分离,形成不同颜色的色带。他把这种方法命名为不同颜色的色带。他把这种方法命名为色谱法(色谱法(Chromatography)。)。 气相液相色谱技术及应用l1931年,年,Kuhn和和Lederer用填充氧化铝粉用填充氧化铝粉末的柱管将胡萝卜素中两种性质非常相末的柱管将胡萝卜素中两种性质非常相似的烃的异构体(似的烃的异构体(-和和-胡萝卜素)胡萝卜素)分离成功,才引起人们的注意,认识到分离成功,才引起人们的注意,认识到色谱法在分离混合物方面有着广阔的前色谱法在分离混合物方面有着广阔的前景。景。l1940-1943年,年,Tiselius发展了吸附色谱,发展了吸附色谱,并由于在并由于在吸附色谱吸附色谱和电泳等方面做出的和电泳等方面做出的重要贡献而获得重要贡献而获得1948年的诺贝尔化学奖。年的诺贝尔化学奖。l1941年,年,Martin和和Synge在研究氨基酸分在研究氨基酸分离时又发明了离时又发明了分配色谱分配色谱法,他们因此获法,他们因此获得了得了1952年诺贝尔化学奖。年诺贝尔化学奖。 气相液相色谱技术及应用气相液相色谱技术及应用l色谱是一种分离技术,当这种分离技术色谱是一种分离技术,当这种分离技术应用于化学分析,就是色谱分析应用于化学分析,就是色谱分析l色谱分析的基本要求是实现各混合物的色谱分析的基本要求是实现各混合物的分离分离l它的分离原理是使混合物中各组分在两它的分离原理是使混合物中各组分在两相间进行分配:即固定相、流动相相间进行分配:即固定相、流动相l固定相分两类:活性固体、活性液体固定相分两类:活性固体、活性液体l流动相一般为惰性气体或有机溶剂流动相一般为惰性气体或有机溶剂气相液相色谱技术及应用1.色谱法分类色谱法分类 按两相物理状态分类:按两相物理状态分类:气气-固色谱(固色谱(gas-solid chromatography, GSC)气气-液色谱(液色谱(gas-liquid chromatography, GLC)液液-固色谱(固色谱(liquid -solid chromatography, LSC)液液-液色谱(液色谱(liquid-liquid chromatography, LLC) 按固定相形态分类:按固定相形态分类: 填充柱色谱填充柱色谱柱色谱柱色谱 毛细柱色谱(开管式色谱)毛细柱色谱(开管式色谱) 气相液相色谱技术及应用1.色谱法分类色谱法分类 按分离过程物理化学原理分类:按分离过程物理化学原理分类:吸附色谱吸附色谱:用固体吸附剂做色谱固定相,样品各:用固体吸附剂做色谱固定相,样品各组分在吸附剂上吸附力大小不同。组分在吸附剂上吸附力大小不同。分配色谱分配色谱:用液体做固定相,利用试样组分在固:用液体做固定相,利用试样组分在固定相中溶解、吸收或吸着能力不同,因而两相定相中溶解、吸收或吸着能力不同,因而两相分配系数不同进行分离。分配系数不同进行分离。离子交换色谱:离子交换剂为固定相,分离离子离子交换色谱:离子交换剂为固定相,分离离子型化合物型化合物还有:离子对色谱、凝胶色谱、络合色谱、亲和还有:离子对色谱、凝胶色谱、络合色谱、亲和色谱等。色谱等。气相液相色谱技术及应用2.色谱过程色谱过程: 由于各组分在固定相的分配系数或吸由于各组分在固定相的分配系数或吸附和脱附能力有差异,各组分在色谱柱中附和脱附能力有差异,各组分在色谱柱中的滞留时间也就不同,即它们在柱中向前的滞留时间也就不同,即它们在柱中向前移动的速率不同。移动的速率不同。 随着流动相不断流过,组分在柱中两随着流动相不断流过,组分在柱中两相间经过了反复多次的分配和平衡过程,相间经过了反复多次的分配和平衡过程,当移动一定柱长以后,试样中各组分即可当移动一定柱长以后,试样中各组分即可得到较完整的分离。得到较完整的分离。 气相液相色谱技术及应用1基线基线 2色谱峰色谱峰 3峰高与峰面积峰高与峰面积 4 保留时间保留时间 气相液相色谱技术及应用气相液相色谱技术及应用色谱图:色谱图:气相液相色谱技术及应用气相液相色谱技术及应用流 动 相流 动 相供 输 系供 输 系统统进 样进 样器器色谱柱(色谱柱(恒温箱)恒温箱)检测器(检测器(恒温箱)恒温箱)数据处理数据处理系统系统组分收集组分收集系统系统控制显示系控制显示系统统(计算机)(计算机)气相液相色谱技术及应用气相液相色谱技术及应用气相液相色谱技术及应用气相液相色谱技术及应用l流动相:气流动相:气-液色谱分离中载气是惰性的,液色谱分离中载气是惰性的,仅携带样品通过色谱柱。气仅携带样品通过色谱柱。气-固色谱载气固色谱载气与组分一起与固体吸附剂作用,因而对与组分一起与固体吸附剂作用,因而对气谱分离具有一定影响。气谱分离具有一定影响。l一般载气主要为:氮、氢、氦、氩、空一般载气主要为:氮、氢、氦、氩、空气、氧气、二氧化碳等。气、氧气、二氧化碳等。l要求:纯度高要求:纯度高气相液相色谱技术及应用l进样系统:进样就是把试样快速、进样系统:进样就是把试样快速、准确的加到色谱柱头。若试样为纯准确的加到色谱柱头。若试样为纯液体或溶液,则要求在进样系统中液体或溶液,则要求在进样系统中瞬间气化。进样系统包括进样口、瞬间气化。进样系统包括进样口、气化室。气化室的温度通常比试样气化室。气化室的温度通常比试样中最难气化的组分的沸点高中最难气化的组分的沸点高50。 气相液相色谱技术及应用l气谱柱:色谱柱包括填充柱和毛细柱,填充柱气谱柱:色谱柱包括填充柱和毛细柱,填充柱是在柱内均匀、紧密填充固定相颗粒的色谱柱。是在柱内均匀、紧密填充固定相颗粒的色谱柱。填充柱管通常用玻璃、金属(不锈钢、铜、铝)填充柱管通常用玻璃、金属(不锈钢、铜、铝)或聚四氟乙烯制成。柱长或聚四氟乙烯制成。柱长1-3m。填充剂可以是。填充剂可以是吸附剂(气吸附剂(气- -固色谱),也可以是涂有固定液固色谱),也可以是涂有固定液的载体(气的载体(气- -液色谱)。毛细柱一般为开管柱,液色谱)。毛细柱一般为开管柱,即在毛细柱内壁上涂有固定液。即在毛细柱内壁上涂有固定液。 气相液相色谱技术及应用l固定相固定相: : 气气- -固色谱以固体吸附剂作为固定相,例固色谱以固体吸附剂作为固定相,例如:炭质吸附剂、硅胶、氧化铝等。如:炭质吸附剂、硅胶、氧化铝等。 气气- -液色谱以涂有固定液的载体作为固定液色谱以涂有固定液的载体作为固定相。固定液系涂渍在载体表面上起分离相。固定液系涂渍在载体表面上起分离作用的物质,在操作温度下不易挥发的作用的物质,在操作温度下不易挥发的物质。例如:聚硅氧烷物质。例如:聚硅氧烷 。气相液相色谱技术及应用l检测器:是能检测色谱柱流出组分及这些检测器:是能检测色谱柱流出组分及这些组分量的变化的器件,其功能是将经色谱组分量的变化的器件,其功能是将经色谱分离的组分的物质信号转化为易于测量的分离的组分的物质信号转化为易于测量的电信号,故也称为电信号,故也称为“换能器换能器”。最常用的。最常用的检测器是热导检测器(检测器是热导检测器(TCD)和火焰离子)和火焰离子化检测器(化检测器(FID)。此外,电子俘获检测器)。此外,电子俘获检测器(ECD)和火焰光度检测器()和火焰光度检测器(FPD)也用)也用得比较多。得比较多。气相液相色谱技术及应用l1、为什么程序升温可以更好的实现混合、为什么程序升温可以更好的实现混合物的分离?物的分离?气相液相色谱技术及应用l恒温气相色谱的柱温恒定在试样平均沸恒温气相色谱的柱温恒定在试样平均沸点,如试样的沸程很宽,则低沸点组分点,如试样的沸程很宽,则低沸点组分因柱温太高而色谱峰窄,相互重叠,而因柱温太高而色谱峰窄,相互重叠,而高沸点组分又因柱温太低,洗出很慢,高沸点组分又因柱温太低,洗出很慢,有些甚至不能洗出有些甚至不能洗出 如果采用程序升温,采用足够低的初始如果采用程序升温,采用足够低的初始温度,低沸点组分最先洗出,得到很好温度,低沸点组分最先洗出,得到很好分离,随着柱温升高,较高沸点的组分分离,随着柱温升高,较高沸点的组分也能较快洗出,得到良好的峰形也能较快洗出,得到良好的峰形气相液相色谱技术及应用l2、为什么需要分流?、为什么需要分流? 由于开管柱载气体积流速很小,将样品由于开管柱载气体积流速很小,将样品从汽化室冲洗到色谱柱需要较长时间,从汽化室冲洗到色谱柱需要较长时间,导致进样器内色谱带扩张。此外,开管导致进样器内色谱带扩张。此外,开管柱样品容量小,采用填充柱常规进样方柱样品容量小,采用填充柱常规进样方式,引入样品量将超过色谱柱负荷式,引入样品量将超过色谱柱负荷气相液相色谱技术及应用l3、气谱峰的拖尾与哪些因素有关?如何、气谱峰的拖尾与哪些因素有关?如何消除?消除?气相液相色谱技术及应用l与载体、样品类型、进样量等因素有关。与载体、样品类型、进样量等因素有关。 样品含脂肪烃、芳香烃、烯烃等成较弱样品含脂肪烃、芳香烃、烯烃等成较弱的拖尾;含羟基、羧基的醇、酸等严重的拖尾;含羟基、羧基的醇、酸等严重拖尾;脂类拖尾较小。拖尾;脂类拖尾较小。 进样量小,拖尾弱,进样量大,拖尾严进样量小,拖尾弱,进样量大,拖尾严重。重。气相液相色谱技术及应用l尽量减少进样量尽量减少进样量l形成衍生物形成衍生物气相液相色谱技术及应用l综上所述,使用仪器时,应注意:综上所述,使用仪器时,应注意: 1.样品要进行净化,提纯样品要进行净化,提纯 2.进样量要控制在一定范围内进样量要控制在一定范围内 3.进样要迅速进样要迅速 4.柱温要控制在柱温要控制在300 以内,以免损害柱以内,以免损害柱子子气相液相色谱技术及应用气相液相色谱技术及应用l流动相:种类较多。改变流动相的性质流动相:种类较多。改变流动相的性质和组成,是提高色谱系统分离度和分析和组成,是提高色谱系统分离度和分析速度的重要手段速度的重要手段l基本要求:保持色谱柱的稳定性、化学基本要求:保持色谱柱的稳定性、化学惰性、必须适合所使用的检测器、具有惰性、必须适合所使用的检测器、具有溶解样品的能力、溶剂的清洗和更换方溶解样品的能力、溶剂的清洗和更换方便、毒性小、价格便宜、纯度高便、毒性小、价格便宜、纯度高气相液相色谱技术及应用l色谱柱:采用优质不锈钢管或硬质玻璃色谱柱:采用优质不锈钢管或硬质玻璃管。最好是直形柱。装柱方法复杂,需管。最好是直形柱。装柱方法复杂,需要高压泵加压。要高压泵加压。l硅胶是高效液相色谱应用最多的固定相硅胶是高效液相色谱应用最多的固定相填料。最重要的有两种:表面多孔层硅填料。最重要的有两种:表面多孔层硅胶,全多孔微粒硅胶。胶,全多孔微粒硅胶。气相液相色谱技术及应用l高压泵:它将流动相在高压下连续不断地高压泵:它将流动相在高压下连续不断地送入色谱系统。高压泵的性能直接影响整送入色谱系统。高压泵的性能直接影响整机的稳定性、重复性和分析精度。机的稳定性、重复性和分析精度。 它应具有如下性能:流量稳定;流它应具有如下性能:流量稳定;流量范围宽,且连续可调;输出压力高、密量范围宽,且连续可调;输出压力高、密封性能好;耐腐蚀;操作、更换溶剂方便封性能好;耐腐蚀;操作、更换溶剂方便。气相液相色谱技术及应用l检测器:常用的有紫外检测器检测器:常用的有紫外检测器(ultraviolet detector, UV)和荧光检测)和荧光检测器(器(fluorescence detector, FD)。)。气相液相色谱技术及应用1 、气相色谱法气相色谱法 (1)高选择性:能够分离分析性质极为)高选择性:能够分离分析性质极为相近的物质相近的物质 (2)高效能)高效能 (3)高灵敏度)高灵敏度 (4)分析速度快)分析速度快 但由于它要求试样必须能够气化,使其但由于它要求试样必须能够气化,使其应用受到一定限制。应用受到一定限制。 气相液相色谱技术及应用2、高效液相色谱法(、高效液相色谱法(HPLC) (1)高效)高效 (2)高速)高速 (3)较高灵敏度)较高灵敏度 (4)高度自动化)高度自动化 气相液相色谱技术及应用(1)HPLC不受试样挥发性和相对分子质量的限制,不受试样挥发性和相对分子质量的限制,可用于分离高沸点、相对分子质量大、热稳定性差可用于分离高沸点、相对分子质量大、热稳定性差的有机化合物,还可用于各种离子的分离。的有机化合物,还可用于各种离子的分离。(2)HPLC不仅可利用被分离组分的极性差别,还不仅可利用被分离组分的极性差别,还可利用组分分子尺寸大小的差别、离子交换能力的可利用组分分子尺寸大小的差别、离子交换能力的差别以及生物分子间亲和力的差别进行分离。它还差别以及生物分子间亲和力的差别进行分离。它还可以用多种溶剂作为流动相,对于性质和结构类似可以用多种溶剂作为流动相,对于性质和结构类似的物质,分离的可能性比气相色谱法更大。的物质,分离的可能性比气相色谱法更大。(3)HPLC易于收集流出的组分,可利用制备柱进易于收集流出的组分,可利用制备柱进行较大量的制备行较大量的制备。 气相液相色谱技术及应用多重联用多重联用 气相色谱气相色谱-质谱(质谱(GC-MS)液相色谱)液相色谱-质谱(质谱(LC-MS)曾经是实验室里最需要)曾经是实验室里最需要并被认为是一定会出现的技术装备。并被认为是一定会出现的技术装备。 今天的色谱技术发展是日新月异,不今天的色谱技术发展是日新月异,不但与质谱连用,还与液谱、红外光谱仪、但与质谱连用,还与液谱、红外光谱仪、EAG等连用,大大的加大了其应用范围。等连用,大大的加大了其应用范围。 气相液相色谱技术及应用气谱进气谱进样口样口毛细管毛细管柱柱触 角 检触 角 检测器测器双通道记双通道记录仪录仪气谱的气谱的FID检测器检测器气相液相色谱技术及应用l气相色谱应用于昆虫化学生态学气相色谱应用于昆虫化学生态学昆虫性信息素的研究昆虫性信息素的研究 昆虫抑卵信息素的昆虫抑卵信息素的 研究研究气相液相色谱技术及应用l气相色谱应用于昆虫化学生态学气相色谱应用于昆虫化学生态学昆虫性信息素的研究昆虫性信息素的研究 昆虫抑卵信息素的昆虫抑卵信息素的 研究研究气相液相色谱技术及应用气相液相色谱技术及应用气相液相色谱技术及应用l在昆虫分类中的应用在昆虫分类中的应用 利用气相色谱技术对昆虫表皮碳氢化合物进利用气相色谱技术对昆虫表皮碳氢化合物进行分析,并以此来对昆虫进行分类鉴定,是行分析,并以此来对昆虫进行分类鉴定,是近年来昆虫分类研究的一种新方法。它主要近年来昆虫分类研究的一种新方法。它主要用于近缘种及种下类群的分类研究。用于近缘种及种下类群的分类研究。 例如:用气相色谱例如:用气相色谱(GC)分析冈比亚按蚊分析冈比亚按蚊(Anopheles gambiae)复合组中两个近缘种)复合组中两个近缘种An. arabiensis、An. gambiae,结果发现,结果发现C25-39的化合物分布有种间差异。的化合物分布有种间差异。 气相液相色谱技术及应用1.开氮气,平衡十分钟开氮气,平衡十分钟2.打开气相色谱仪开关,转换器开关,计算机开关打开气相色谱仪开关,转换器开关,计算机开关3.打开打开Class-GC10程序程序4.调出调出realtime 系统,设置程序升温,点击系统,设置程序升温,点击system on,激活,激活5.开氢气、空气,平衡十分钟开氢气、空气,平衡十分钟6.点火点火气相液相色谱技术及应用l关机关机1.设置降温程序:进样口、柱温、检测器都为设置降温程序:进样口、柱温、检测器都为25,等待降温。,等待降温。2.降温之后,关闭程序降温之后,关闭程序3.关机,关闭色谱仪,转换器,拔掉电源。关机,关闭色谱仪,转换器,拔掉电源。4.关氢气、氮气、空气。关氢气、氮气、空气。5 5整理桌面,关灯。整理桌面,关灯。 气相液相色谱技术及应用l工作站结构包括:修改和设定气谱条件工作站结构包括:修改和设定气谱条件部分部分(configuration)(configuration),实时分析系统,实时分析系统(real time analysis)real time analysis),分析数据和修,分析数据和修改文件部分改文件部分(post run analysis)(post run analysis)等。等。l它可以把电信号传输到电子计算机上,它可以把电信号传输到电子计算机上,并且进行分析。大大减轻了研究者的劳并且进行分析。大大减轻了研究者的劳动量。动量。 气相液相色谱技术及应用打开打开real time analysisreal time analysis,打开,打开setupsetup窗口,窗口,进入进入TempTemp窗口,设置柱温,检测器,进窗口,设置柱温,检测器,进样口温度及升温程序,点击样口温度及升温程序,点击system onsystem on,打开打开GC MonitorGC Monitor。等到窗口出现等到窗口出现ReadyReady,进入,进入Sample LoginSample Login窗窗口,输入分析试样资料,保存。口,输入分析试样资料,保存。进样,点击进样,点击start,start,开始分析。开始分析。气相液相色谱技术及应用
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