垂体瘤转化基因在垂体细胞衰老和垂体瘤生成中机制的研究

垂体瘤转化基因在垂体细胞衰老和垂体瘤生成中机制的研究 摘要 目的 探讨垂体瘤转化基因（PTTG）在垂体细胞衰老和垂体瘤中表达规律。 方法 构建F344大鼠D-半乳糖诱导衰老模型和雌激素诱导泌乳素腺瘤模型。观察大鼠的衰老表型及成瘤情况，对大鼠垂体进行病理学检测，分子生物学方法检测垂体PTTG、P53、P21、P16蛋白表达。 结果 D-半乳糖成功诱导大鼠出现明显衰老特征，雌激素诱导大鼠成功生成泌乳素腺瘤；衰老大鼠垂体胞质内有空泡和异染色质生成，肿瘤大鼠垂体PRL免疫组化为强阳性；RT-PCR显示雌激素诱导组PTTG mRNA表达为（12.991.86），D-半乳糖诱导衰老组PTTG表达为（2.100.23），差异有高度统计学意义（P 0.01）；D-半乳糖诱导衰老组P53、P16、P21 mRNA表达为（113.5123.87）、（29.264.44）、（67.2110.08），在雌激素诱导垂体瘤组中表达为（83.268.06）、（9.832.13）、（28.192.01），两组比较差异有统计学意义（P 0.05）。Western-blot条带积分灰度值显示D-半乳糖诱导衰老组PTTG、P21、P16蛋白表达为（0.198 0.032）、（1.2390.051）、（1.6730.055），雌激素诱导垂体瘤中表达为（1.0020.041）、（0.2020.055）、（0.409 0.059），两组比较差异有统计学意义（P 0.05）。 结论 PTTG基因过表达导致衰老绕过，垂体瘤形成。PTTG表达减弱，诱导衰老。P16、P21是垂体细胞衰老重要的调控因子。 关键词 垂体瘤转化基因；垂体瘤；衰老 中图分类号 R736.4 文献标识码 A 文章编号 1673-7210（2015）05（c）-0007-05 Abstract Objective To investigate the pituitary tumor transforming gene （PTTG） expression pattern in pituitary cell senescence and pituitary adenoma tumorigenesis. Methods D-galactose induced F344 rats aging model. The rats aging expression and tumor generation condition were observed through pathological detection， molecular biology method was used to measure the expression of PTTG， P53， P21， P16 in pituitary tissue. Results D-galactose induced F344 rats showed significant characteristics of aging and oestrogen induced rats successfully generated prolactin adenoma； aging Rats visible cytoplasmic vacuoles occurred， heterochromatin exists in the pituitary cell， pituitary PRL immunohistochemical was strong positive in tumor group rats； RT-PCR showed that PTTG mRNA expression in estrogen induced pituitary adenoma group was （12.991.86）， PTTG expression of D-galactose induced aging group was （2.100.23）， the difference was statistically significant （P 0.01）； P53， P16， P21 mRNA expression of D-galactose induced aging group was （113.5123.87）， （29.264.44）， （67.2110.08）， P53， P16， P21 mRNA expressed in estrogen induction of pituitary adenoma group was （83.268.06）， （9.832.13）， （28.192.01）， the differences were statistically significant （P 0.05）； Western-blot strip integral grey value showed PTTG， P21 and P16 protein expression of D-galactose induced aging group was （0.1980.032）， （1.2390.051）， （1.6730.055） and expressed in estrogen induced pituitary adenoma group was （1.0020.041）， （0.2020.055）， （0.4090.059）， the differences were statistically significant （P 0.05）. Conclusion PTTG over-expression leads to senescence bypassed pituitary adenoma formation， PTTG weak expression leads to senescence. P16， P21 are important regulatory factors in pituitary cell senescence. Key words Pituitary tumor transforming gene； Pituitary adenoma； Senescence 垂体瘤转化基因（pituitary tumor transforming gene，PTTG）是1997年Pei等1首次从大鼠垂体瘤组织中发现的新癌基因，PTTG在垂体腺瘤及其他肿瘤中均有较高水平的表达，与肿瘤的侵袭性、转移、血管形成、复发、预后密切相关2-3。近期Chesnokova等4研究发现垂体细胞内PTTG水平表达降低和缺失会诱发DNA损伤调控反应（DNA damage checkpoint response，DDR）导致衰老产生，进而阻止肿瘤发生及恶变，说明垂体瘤增殖过程存在衰老。提出癌基因的活化既可以导致肿瘤产生，又可以诱导细胞衰老，称作癌基因诱导细胞衰老（oncogene-induced senescence，OIS）5。癌基因具有诱导肿瘤衰老和肿瘤增殖恶变的能力，设想通过调控癌基因诱导肿瘤细胞衰老，可以作为治疗肿瘤的新方向。本研究拟通过建立F344 大鼠D-半乳糖亚急性衰老模型，同时通过雌激素诱导大鼠泌乳素腺瘤形成，探讨PTTG及衰老通路中相关因子在垂体细胞衰老和垂体瘤生长过程中的表达，初步阐明癌基因诱导衰老在垂体瘤发生过程中作用机制。 1 材料与方法 1.1 实验动物 100 g左右4周龄雌性F344大鼠18只购自北京维通利华实验动物中心，许可证号SCXK（京）2012-0001。随机分为三组，正常对照组、D-半乳糖诱导衰老组和雌激素诱导垂体瘤组，每组各6只。本研究经牡丹江医学院动物伦理委员会批准，严格按照NIH实验动物伦理原则进行操作。 1.2 主要试剂及设备 98%的-雌二醇（Sigma公司），98%的D-半乳糖（Sigma公司），医用硅胶管（内经2 mm，外径3 mm，济南晨生医用导管公司），鼠抗鼠单克隆PTTG抗体（abcam公司），鼠抗鼠单克隆P16抗体（abcam公司）。SYBR green master rox（Roche公司），transcriptor first strand cDNA Synthesis Kit（Roche公司）。 1.3 构建大鼠衰老模型及垂体泌乳素腺瘤模型 10%水合氯醛按0.2 mL/100g腹腔注射麻醉，将含有10 mg E2无菌硅胶管植入雌激素诱导垂体瘤组大鼠背部皮下，正常对照组及D-半乳糖诱导衰老组植入含有生理盐水的硅胶管。D-半乳糖诱导衰老组于术后7 d连续腹腔内注射D-半乳糖200 mg/（kgd），造成亚急性衰老；正常对照组、雌激素诱导垂体瘤组术后7 d腹腔内注射同等量生理盐水对照。观察各组大鼠的精神状态、体重、进食及尿量、肌肉是否有萎缩、毛发光泽度及有无脱毛等。术后第8周，断头处死全部大鼠。解剖垂体，观察垂体形状、大小、质地及颜色，同视神经及颈内动脉比邻关系，观察垂体窝鞍底形状，骨质是否破坏。 1.4 垂体病理学检测 垂体标本常规HE染色，采用S-P法进行免疫组化染色，一抗为大鼠PRL单克隆抗体（murine，Dako公司，美国）。用PBS代替一抗平行染体做阴性对照。 1.5 RT-PCR检测垂体组织中PTTG、P53、P21、P16 mRNA表达 PTTG、P53、P21、P16基因的引物由生工生物工程（上海）有限公司合成。按照93，3 min；95，1 min，60 30 s，72 30 s，72 30 s，72 4 min；30 cycle扩增目的基因，对每个基因设-actin做内参，内参基因为Rps16。 1.6 Western-blot检测垂体组织中PTTG、P16、P21表达 每组取3只大鼠垂体组织，提取垂体组织总蛋白，进行SDS-PAGE电泳，滴加稀释的Anti-p16 antibody、Anti-p21 antibody，Anti-PTTG antibody，DAB显色。照相记录图像，蛋白感光条带用Kodak Carestream Molecular Imagine 软件测量积分灰度值，以各组蛋白表达量与-Action比值进行半定量分析，显示目的基因的蛋白表达水平。 1.7 统计学方法 实验数据采用GraphPad Prism 5.0进行分析，正态分布计量资料以均数标准差（xs）表示，多组间比较采用方差分析，两两比较采用LSD-t检验。以P 0.05为差异有统计学意义。 2 结果 2.1 动物一般状态 6周后，D-半乳糖诱导衰老组大鼠出现精神萎靡、毛色晦暗，背部及面颊部脱毛；与正常对照组比较，尿量有所增加，差异有统计学意义（P 0.05）。与正常对照组比较，雌激素诱导垂体瘤组大鼠尿量明显增加，差异有高度统计学意义（P 0.01）。见表1。 2.2 解剖学观察 雌激素诱导垂体瘤组大鼠垂体重量高于正常对照组，差异有高度统计学意义（P 0.01）。D-半乳糖诱导衰老组大鼠垂体重量小于正常对照组大鼠，差异有统计学意义（P 0.05）；D-半乳糖诱导衰老组大鼠垂体重量明显小于雌激素诱导垂体瘤组，差异有高度统计学意义（P 0.01）。见表1。正常对照组垂体粉红色，位于鞍内，双侧视神经之间，其上覆盖鞍隔。D-半乳糖诱导衰老组垂体明显缩小，表面皱缩，质地较韧。雌激素诱导垂体瘤组垂体窝明显扩大，形成大于正常对照组数倍体积的肿瘤，鞍底骨质受压变薄，视神经移位，鞍隔上抬，肿瘤有假包膜存在，质地软，分离肿瘤易出血。 2.3 垂体组织学观察 雌激素诱导垂体瘤组细胞排列紊乱，正常垂体腺管样结构消失，核大小不一致，可见不典型性增生呈肿瘤样改变；D-半乳糖诱导衰老组垂体细胞明显减少，细胞间隙扩大，血管网稀疏，部分细胞浆内出现空泡样改变，细胞膜皱缩，异染色质形成存在于细胞内。D-半乳糖诱导衰老组内PRL基本没有表达，无明显细胞内颗粒染色，正常对照组有PRL低表达，镜下阳性细胞占比例很少，雌激素诱导垂体瘤组大于80%细胞内表达阳性。见图1（封三）。 2.4 RT- PCR检测垂体组织内PTTG、P53、P16、P21 mRNA表达 RT-PCR显示雌激素诱导组PTTG mRNA表达最高为（12.991.86），D-半乳糖诱导衰老组PTTG表达最低为（2.100.23），差异有高度统计学意义（P 0.01）；D-半乳糖诱导衰老组P53、P16、P21 mRNA表达最高为（113.5123.87）、（29.264.44）、（67.2110.08），在雌激素诱导垂体瘤组中表达略升高，分别为（83.268.06）、（9.832.13）、（28.192.01），两组比较差异有统计学意义（P 0.05）。见图2。 2.5 Western-blot检测垂体组织中PTTG、P16、P21蛋白表达 Western-blot条带积分灰度值显示D-半乳糖诱导衰老组PTTG、P21、P16蛋白表达为（0.1980.032）、（1.2390.051）、（1.6730.055），雌激素诱导垂体瘤中表达为（1.0020.041）、（0.2020.055）、（0.409 0.059），两组比较差异有统计学意义。其中雌激素诱导垂体瘤组PTTG表达最高，D-半乳糖诱导衰老组垂体中表达最低。P16、P21在D-半乳糖诱导衰老组垂体表达最高，在雌激素诱导垂体瘤组中表达最低。见图3。 3 讨论 组织学上大多数垂体腺瘤是良性肿瘤，虽然部分垂体瘤表现侵袭性生长，但很少有恶变和远处转移。部分垂体微腺瘤表现为停止生长，微小泌乳素腺瘤能够进行自我消除，说明在垂体瘤发生中存在内在的衰老机制6。不可逆的生长抑制和具有代谢活性是细胞衰的老两个标志性特征，表现为半乳糖苷酶（-galactosidase，SA-GAL）活性增加和异染色质凝聚（senescence-associated heterochromatic foci，SAHF），研究发现DNA损伤和癌基因活化均可诱导细胞衰老5，7。癌基因诱导衰老是癌基因突变所产生的异常增殖信号，通过P16INK4A-Rb，ARF-P53-P21信号通路激活衰老，造成癌基因不稳定性增加，恢复和提升肿瘤抑制基因活性，使细胞处于生长停滞状态，抑制肿瘤细胞增殖，是预防肿瘤发生及恶变的重要保护屏障7-9。所以对垂体泌乳素腺瘤的癌基因PTTG进行研究，探讨其是否参与垂体细胞的早熟及增殖衰老中，有助于重新认识垂体瘤的发生机制，为垂体瘤治疗提供新的思路和方法。 PTTG是有丝分裂中的安全素样蛋白具有分离蛋白抑制酶活性，能阻断有丝分裂过程中姐妹染色体的分离，引起非整倍体出现，导致基因不稳定和细胞恶性转化，同时PTTG有效调控下游目标靶基因，如成纤维细胞生长因子2（bFGF-2）及C-myc、P21、MMP2、cyclinD3等表达，导致肿瘤血管形成、转移、侵袭力增强等，与肿瘤的转移、预后密切相关10-12。近期研究发现PTTG能够干扰P53与DNA的结合能力，抑制P53下游基因P21的转录活性和蛋白表达，从而抑制P53介导的细胞凋亡，促进肿瘤增殖，在垂体腺瘤的形成和生长过程中起重要的作用。PTTG发挥调节衰老和凋亡主要通过蛋白-蛋白之间相互作用、细胞因子旁分泌-自分泌刺激和激活靶基因三条途径完成13-15。本次实验结果显示在雌激素诱导垂体瘤组大鼠中PTTG mRNA表达水平较其他组明显增高，在D-半乳糖诱导衰老组垂体中PTTG表达明显降低，所以PTTG可以看作垂体瘤的癌基因，PTTG的持续作用可以促进肿瘤细胞增殖。 癌基因诱导衰老能抑制肿瘤细胞增殖，主要是通过P16INK4A-pRb和ARF-P53这两条信号通路发挥作用，P16和P21-P53是衰老信号通路网络中的两个重要的控制节点13，16。对垂体瘤细胞衰老的研究发现，敲除PTTG的垂体细胞启动了依赖P53-P21的衰老途径，抑制了细胞周期进展所需的CDK2活性、Rb基因磷酸化等，从而抑制肿瘤增殖4，17。研究发现PTTG基因缺失裸鼠中表现明显垂体衰老特点，触发ARF-P53-P21衰老信号通路，使凋亡阻滞，诱导衰老产生，阻止垂体瘤产生。PTTG主要通过调控P21的表达而影响细胞衰老的进程。但是奇怪的是，在GH3细胞系中，过表达PTTG反而会上调P21的表达，从而促进衰老的发生。PTTG表达与P21呈负相关，调节P21会减弱PTTG表达，抑制肿瘤增殖。此研究同时指出PTTG表达水平过低诱发垂体细胞衰老，PTTG表达过高，绕过衰老，形成肿瘤。说明PTTG的表达失衡，诱发和绕过衰老，本实验也证实垂体内PTTG表达失衡导致垂体瘤生成15，17。 细胞衰老及凋亡都是通过激活P53下游靶基因P21而触发。本实验发现亚急性衰老大鼠垂体P53蛋白表达明显增高，研究也指出P53仅仅在肿瘤生长早期（未成熟衰老）表达升高13，18，本实验也发现P53在雌激素诱导垂体瘤中表达比正常对照组高，说明垂体细胞在经历了癌基因刺激后，产生DNA损伤突变，肿瘤生成过程中存在P53蛋白参与的细胞衰老，引进并保持垂体肿瘤细胞一定程度的衰老，抑制垂体瘤细胞进一步增殖，说明在垂体衰老中P53蛋白参与调控衰老和维持衰老。 P21是P53的一个经典靶基因，同时也是细胞周期负性调控因子，与细胞凋亡和衰老密切相关19。本实验发现P21在衰老组垂体细胞中的表达是肿瘤细胞组的3倍，提示垂体细胞衰老与P21的诱导密切相关。衰老组PTTG表达水平降低，癌基因表达失衡能激活P53使P21表达增加，引起细胞衰老，表明P21参与诱发垂体细胞衰老与癌基因刺激的丧失密切相关。当癌基因表达水平下降的时候，P21由于失去癌基因刺激产生早熟衰老，引起细胞生长停滞，设想提高P21表达能够诱导衰老和限制垂体瘤细胞增殖和恶变13。 P16基因是细胞周期依赖性激酶CDK4抑制剂，P16INK4A同CDK4结合调控视网膜母细胞瘤Rb蛋白磷酸化水平，使Rb基因与转录因子E2F相结合，处于非磷酸化状态，进而抑制细胞由G1期进入S期，导致细胞生长停滞，产生衰老，因此又称为衰老相关基因20。P16有特异的自我更新功能，能够持续的表达，维持衰老通路的完整性19-20。本实验发现正常对照组内P16水平也较垂体瘤组内升高，也行正常垂体内存在一定程度的衰老，正常的垂体衰老是抑制内分泌细胞过度增殖导致分泌激素过量，是机体的一种平衡和保护机制。垂体瘤内P16水平下降并与P21表达正相关，说明大鼠在雌激素及癌基因的持续刺激下，P16表达下降，早熟衰老消失，肿瘤增殖。所以如何提高肿瘤进展期衰老相关基因表达，诱导衰老限制肿瘤增殖和恶性变，是将来研究的重点。 本实验证实在衰老垂体呈中PTTG表达水平明显下降，与P53、P21、P16表达负相关，说明D-半乳糖激活垂体细胞ARF-P53-P21/PRb-P16衰老通路，P53、P21表达提升，抑制PTTG的表达，引起细胞生长停滞。而雌激素作用引起PTTG表达增高，导致姐妹染色体分离受限，细胞周期停滞，非整倍体形成，发生了癌基因表达水平失衡诱发的早熟衰老，但是由于雌激素持续释放，PTTG明显升高产生衰老绕过，进一步引起细胞损伤，产生垂体瘤细胞增殖。设想通过调控PTTG诱发衰老，使垂体瘤细胞增殖停滞、侵袭性降低、激素异常分泌，有较大临床应用前景。 参考文献 1 Pei L，Melmed S. 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