实验八 酶性质——最适PH选择

生物化学实验报告酶性质最适PH选择酶性质最适PH选择姓名：周超学号：201100140067班级：11级生命基地同组者：刘炳煜时间：2011年5月9日【实验目的】1、熟悉并掌握用酶最适PH选择的方法。2、学会寻找酶最适反应时间的方法。【实验原理】酶的催化活性与环境PH有密切关系，通常各种酶只在一定PH范围内才有活性，酶活性最高时的PH，称为酶的最适PH。高于或者低于此PH时酶的活性逐渐降低。值得指出的是，不同的酶最适PH也不同，如胃蛋白酶的最适PH为1.5-2.5，胰蛋白酶的最适PH为8.0。酶的最适PH不是一个特征性的物理常数，而对于同一个酶，其最适PH因缓冲液和底物的性质不同而有差异。如唾液淀粉酶的最适PH为6.8，但在磷酸缓冲液中，其最适PH为6.4-6.6，而在乙酸缓冲液中则为5.6。【实验试剂】1.0.3%NaCl2.0.5%的淀粉3.用0.2M Na2HPO4 和0.1M的柠檬酸溶液配制的PH为5.4、6.0、6.4、6.8、7.2、7.6、8.0的缓冲液PH5.46.06.46.87.27.68.00.2M Na2HPO411.1512.6313.8530.917.3918.7319.450.1M柠檬酸8.857.376.159.12.611.270.55【实验步骤】1、确定合适的保温时间保温时间是指从加入酶液开始到从水浴中取出试管加入碘液的一般时间。取一支试管，加入0.3%NaCl、0.5%淀粉各2ml，PH6.8的Na2HPO4-柠檬酸缓冲液3ml和稀释100-300倍的唾液2ml，充分摇匀，放入37度水浴保温。计时，每隔1min滴一滴混合液于点滴板上，加1滴碘液，检验淀粉水解程度，呈橙黄色时，加一滴碘液于试管中，若为橙黄色表示反应完全，记录保温时间。若2-3min内，保温液与碘液作用呈橙黄色，则说明酶活力太高，应再稀释唾液淀粉酶，记录稀释倍数。若保温时间超过15min，说明酶活力太低，需要提高酶的浓度。最佳保温时间为8-15min内。2、确定最适PH取7支试管按下表操作，保温时间参考步骤1试剂（ml）1234567PH值5.46.06.46.87.27.68.00.3%NaCl 0.5%淀粉2222222相应PH缓冲液3333333每隔1min加入唾液淀粉酶2222222充分摇匀，37度水浴保温，到达保温时间后，每隔1min依次取出立即加入碘液1滴摇匀从各管呈现的颜色，判断不同PH对淀粉水解和淀粉酶活性的影响，并确定其最适PH。【实验结果】由颜色梯度可以得出，唾液淀粉酶的最适PH为6.8。【思考讨论】结果分析：由颜色梯度可以看出，在PH=6.8时，加入碘液后混合液的颜色最浅，因此，唾液淀粉酶的最适PH为6.8，PH值高于或者低于6.8，唾液淀粉酶的活力都会受到抑制。注意事项：（1） 本次实验成功的关键点之一就是缓冲溶液，一定要保证加入的Na2HPO4 和柠檬酸的体积完全符合要求，并且充分混匀。（2） 实验操作过程中，一定要保证唾液淀粉酶酶液一直处于低温状态，这样有利于保证酶的活力，可以防止酶失活。（3） 唾液淀粉酶的稀释倍数要合理，一般为100-300倍，根据不同的人、不同的时间、不同的心情，酶的稀释倍数做略微调整。酶的稀释倍数以8-15将底物反应完全为佳。（4） 确定合适的保温时间时，尽量是每次滴入点滴板的混合液和碘液体积一样，这样可以防止混合液过少或者碘液过少引起的颜色的误差，干扰最适时间的选择。（5） 最适保温时间一定要确定好，时间太短，最适PH环境下唾液淀粉酶都不能把淀粉消耗尽，时间太长，非最适PH条件下的唾液淀粉酶也能将淀粉耗尽，这些情况都不利于颜色梯度的形成，不利于最终结果的确定。（6） 确定最适PH值时，一定要保证向每只试管中加入的碘液体积一样，以一滴为最佳，这样有利于生成较明显的颜色梯度，也利于最终结果的判断。（7） 在确定最适PH值时，一定要保证每只试管其保温时间是相同的，都是最适保温时间，这样，该实验的单一变量仅为PH，可以准确确定酶的最适PH。