基因工程复习材料

基因工程第一章 绪论1、基因工程也叫基因操作、遗传工程，或重组体DNA技术。一般说来所谓的基因工程是指在体外将核酸分子插入病毒、质粒或其它载体分子，构成遗传物质的新组合，并使之参入到原先没有这类分子的寄主细胞中内，而能持续稳定的繁殖。2、基因工程优点打破了物种之间的界限，可以使原核生物与真核生物之间、动物与植物之间、甚至人与其他生物之间的遗传信息进行重组和转移3、理论依据6 / 61）不同基因具有相同的物质基础 2）基因是可切割的 3）基因是可转移的 4）多肽与基因之间存在对应关系 5）遗传密码是通用的 6）基因可以通过复制把遗传信息传递给下一代4、基因工程研究的基本操作程序a、目的基因的分离和制取b 、表达载体的构建和目的基因与载体的拼接c、 基因转移（导入）d、 转基因植株的再生与检测e 、后代的遗传分析第二章 基因工程工具酶限制性内切酶1、限制(restriction)：指一定类型的细菌可以通过限制酶的作用，破坏入侵的噬菌体DNA，导致噬菌体的寄主幅度受到限制。限制作用:实际就是限制性内切酶降解外源DNA，维护宿主遗传稳定的保护机制。2、修饰(modification)：指寄主本身的DNA，由于在合成后通过甲基化酶的作用得以甲基化，使DNA得以修饰,从而免遭自身限制性酶的破坏。修饰作用:宿主细胞通过甲基化作用达到识别自身遗传物质和外来遗传物质的目的。3、限制性核酸内切酶的概念是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链结构的核酸水解酶。 4、型限制性核酸内切酶限制修饰：单功能蛋白结构：同源三聚体辅助因子：Mg2+ 识别序列：4-6bp回文序列切割位点：识别序列内或附近特异切割5、限制性核酸内切酶的功能限制性核酸内切酶有严格的识别、切割顺序，它以核酸内切方式水解DNA链中的磷酸二酯键，产生的DNA片段5端为P，3端为OH，识别序列一般为46个碱基对，通常是反转录重复顺序，具有180的旋转对称性即迴文结构。限制性核酸内切酶切割双链DNA产生3种不同的切口。 1个单位限制性核酸内切酶：在建议使用的缓冲液及温度下，在20L反应液中反应1h，使1g标准DNA完全消化所需的酶量。6、限制性核酸内切酶的主要用途在特异位点上切割DNA，产生特异的限制性酶片段。建立DNA分子的限制酶图谱。构建基因文库。用限制酶切出的相同粘性末端，以便重组。改建质粒。7、限制性核酸内切酶的星活性(star activity)在极端非标准反应条件下，限制性核酸内切酶能切割与特异识别序列相似的序列,降低酶切反应的特异性,这种改变的特殊性称为限制性核酸内切酶的星活性。星活性产生的原因如下： 反应体系中甘油的浓度大于5%。 酶用量过大，大于100U/微克DNA。 低离子强度，小于25mmol/L。 高pH，大于8.0。 含有机剂，如乙醇、二甲基亚砜、二甲基乙 酰胺等。 Mn2+、Cu2+、Co2+、Zn2+等非Mg2+的二价离子的存在。8、影响限制性核酸内切酶活性的因素DNA样品的纯度DNA样品的甲基化程度 酶切反应的温度DNA分子结构核酸内切酶的缓冲液9、同裂酶与同尾酶同裂酶(isoschizomer):不同来源的限制性核酸内切酶识别与切割相同的核苷酸靶序列，这类酶称为同裂酶。SmaI和XmaI(CCCGGG)。 同尾酶(isocaudarner):不同来源的限制性核酸内切酶识别与切割的核苷酸靶序列也各不相同，但都产生相同的粘性末端，这类酶称为同尾酶。BamHI(GGATCC)和Bgl(AGATCT)。 10、Klenow酶的基本性质：大肠杆菌DNA聚合酶I经枯草杆菌蛋白酶处理,获得N端三分之二的大肽段,即Klenow酶。Klenow酶仍拥有53的DNA聚合酶活性和35的核酸外切酶活性，但失去了5 3的核酸外切酶活性。 11、Klenow酶的基本用途： 补平由核酸内切酶产生的3粘性凹出末端 抹平DNA的3粘性凸出末端 DNA片段的同位素末端标记 cDNA第二链的合成 双脱氧末端终止法测定DNA序列12、T4 DNA连接酶的作用机制DNA连接酶是一种能够催化在两条DNA链之间形成磷酸二酯键的酶，已发现的DNA连接酶主要有两种：T4 DNA连接酶和大肠杆菌DNA连接酶。T4 DNA连接酶的作用机制：ATP+DNA ligase(E) E-AMP+PPi。E-AMP上的AMP转移到DNA的5磷酸根上，使其活化，释放出酶。活化的5磷酸根与相邻的3羟基形成3，5磷酸二酯键，并释放出AMP。 第三章 基因工程载体载体（vector）是由在细胞中能够自主复制的分子构成的一种遗传成分，通过实验手段可使其它的片段连接在它的上面，而进行复制质粒（plasmid）是存在于细菌染色体外的小型环状双链DNA 分子理想质粒载体必备的条件1、具有较小的分子质量和拷贝数2、具有若干限制性内切酶的单一切点3、具有两个以上的选择标记基因4、缺失mob基因: 使基因不会转移5、插入外源基因的重组质粒较易导入宿主细胞并复制和表达第四章 核酸操作的基本技术常用DNA的来源：1、微生物DNA的提取:质粒DNA的提取、病毒DNA的提取、细菌DNA的提取2、动物细胞DNA的提取:组织样品DNA提取、血样中DNA的提取3、植物细胞核DNA的提取:叶片核DNA的提取、愈伤组织核DNA的提取4、核外DNA的提取:线粒体DNA的提取、叶绿体DNA的提取第五章 聚合酶链式反应聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction)简称PCR，是以DNA为模板，利用DNA聚合酶的特性体外扩增特定的基因片断，这种方法被称为DNA聚合酶链式反应。1、PCR扩增原理PCR由变性-退火-延伸三个基本反应步骤构成。类似于DNA的体内复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。模板DNA变性：模板DNA经93左右加热一定时间后，双链DNA模板或经PCR扩增形成的双链DNA解离成为单链。模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合。引物的延伸：DNA模板-引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的单链。2、PCR引物设计原则1.引物长度： 15-30bp，常用为20mer左右引物的有效长度不能大于 38 mer，否则最适延伸温度会超过TaqDNA聚合酶的最适温度（74），不能保证PCR扩增产物的特异性2.引物扩增跨度：以500bp为宜特定条件下可扩增长至10kb的片段3.引物碱基：G+C含量以40-60%为宜G+C太少扩增效果不佳，G+C 过多易出现非特异条带ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列4.避免引物内部出现二级结构避免两条引物间互补， 特别是 3端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异性的扩增条带5.引物 3端的碱基要求严格配对特别是最末及倒数第二个碱基，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败6.引物中有或能加上合适的酶切位点被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点，这对酶切分析或分子克隆很有好处7.引物的特异性引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性8.引物量每条引物的浓度0.1 1umol或10 100 pmol，以最低引物量产生所需要的结果为好引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会3、PCR技术类型a巢式PCR 采用两对引物进行PCR，其中第二对引物位于第一对引物内b不对称PCR（asymmetric PCR）目的：扩增产生特异长度的单链DNA。 方法：采用两种不同浓度的引物。分别称为限制性引物和非限制性引物,其最佳比例一般是0.010.5M,关键是限制性引物的绝对量。 用途：制备核酸序列测定的模板 制备杂交探针 基因组DNA结构功能的研究c反向PCR（inverse PCR）原理是用反向的互补引物来扩增两引物以外的DNA片段对某个已知DNA片段两侧的未知序列进行扩增。d等位基因专一PCR (Allele specific PCR, ASPCR) e竞争引物PCR (competitive oligonucieotide primer PCR,COP-PCR) 有一个碱基变化的两种引物在较宽松的复性条件下竞争DNA模板，其中只有完全互补的引物才能大量配对。该法可用于测定某一DNA片段上是否带有某一已知碱基置换。f、cDNA末端快速扩增技术g、PCR单链构象多态性（PCR-single strand conformation polymorphism, PCR-SSCP）h、Touch down PCRi、热启动PCRj、差示PCR（DD-PCR)4、PCR技术应用一、核酸的基础研究二、序列分析三、检测基因表达四、从cDNA库中放大特定序列五、研究已知片段邻近基因或未知DNA片段六、进化分析七、医学应用八、分析生物学证据九、性别控制十、转基因检测第六章 基因文库的构建与目的基因的获得1、目的基因的获得方法1）对已知序列基因的分离核酸杂交法 PCR筛选法 表达文库的免疫学筛选法2）对未知序列基因的分离染色体步移杂交捕捉和释放mRNA的差异显示分析限制性标记cDNA扫描人类基因组计划3）基因的人工合成第八章 重组子的筛选与鉴定转化子：导入外源基因DNA分子后能稳定存在的受体细胞；重组子：含有重组DNA分子的转化子；筛选：通过某种特定的方法，如核酸杂交及免疫测定等从受体细胞群体祸基因文库中鉴定出阳性重组子的过程；选择：通过某种外加因素的辨别作用，呈现具有重组DNA分子的特定克隆的方法1、b-半乳糖苷酶显色反应选择法的原理载体上有一段b-半乳糖苷酶基因（Lac Z）的a片段（氨基端），其上有外源DNA的插入位点。 受体菌基因组中有突变的b-半乳糖苷酶基因（ a片段缺失）。可以被IPTG诱导表达。 载体和受体菌基因组可以互补形成完整有功能的b-半乳糖苷酶。2、核酸分子杂交检测法一、原理1. 核酸杂交：重组克隆与探针杂交。2. 检测用的探针：与外源DNA插入片断互补的序列。3. 识别标记（1）放射性同位素：32P 或 125I （2）非放射性标记：荧光素二、核酸杂交检测方法1. Southern blotting用DNA（或RNA）探针检测DNA样品。从宿主细胞中提取DNA（或质粒载体），再用探针杂交。只有带有插入片断的重组载体才能与探针杂交，在底片上曝光显示。2.原位杂交特点：对应的菌斑或噬菌斑位置不变，可以直接找出阳性菌落。3.R-环检测法鉴定出双链DNA中存在的与特定RNA分子同源区域 在临近双链DNA变性温度下和高浓度的甲酰胺溶液中（70%），双链的DNA-RNA分子比双链的DNA-DNA分子更加稳定。 在这种条件下，RNA会同它的双链DNA分子中的互补序列退火形成稳定的RNA-DNA，而被取代的另一条DNA呈单链状态。这种由双链RNA-DNA和单链DNA形成的泡状体称R-环结构。4.Northern blotting用DNA（或RNA）探针检测RNA样品。5.斑点杂交与Southern杂交和原位杂交相似第十一章 植物基因工程植物转化的受体系统，一般是指用于转化的外植体通过组织培养途径活其他非组织培养方法，产生能高效稳定地繁殖无性系，并能接受外源DNA整合、对转化选择抗生素敏感的再生体系。有愈伤组织再生系统、原生质体再生系统、胚状体再生系统、直接分化再生系统和生殖细胞受体系统。1、建立植物转化受体系统的主要考虑因素1）具有稳定的外植体来源2）具有高效稳定的再生能力3) 具有较好的遗传稳定性4）对选择性抗生素敏感2、植物基因的导入方法农杆菌介导法 花粉管通道法 物理与化学方法（基因枪法、聚乙二醇法 电击法 显微注射法 浸渍法）3、动物基因的导入方法DEAE葡萄糖转染法 显微注射法 病毒转染法 胚胎干细胞介导法 精子载体法 基因同源重组法第十三章 分子标记及基因芯片技术与应用1.分子标记的概念与种类广义的分子标记(molecular marker)可遗传的并可检测的DNA序列或蛋白质。蛋白质标记包括种子贮藏蛋白和同工酶（指由一个以上基因位点编码的酶的不同分子形式）及等位酶（指由同一基因位点的不同等位基因编码的酶的不同分子形式）。狭义的分子标记DNA标记 能反映生物个体或种群间基因组中某种差异特征的DNA片段，它直接反映基因组DNA间的差异。种类：1、Hibridisation-based markers以分子杂交为基础的DNA标记技术（RFLP标记、DNA指纹技术、原位杂交 ）2、PCR-based markers以PCR反应为核心的DNA指纹技术 （RAPD标记、SSR标记、SSLP标记、SCAR标记 、AFLP标记、STS标记 ）3、Sequencing based markers新型的分子标记（SNP标记、EST标记 ） 2.分子标记的工作原理3、 分子标记的应用1）分子标记遗传图谱的构建和基因定位2）分子标记辅助育种3）比较基因组分析4）分子标记应用于种质鉴定良种登记、系谱记录的建立及亲缘关系鉴定品种或品系遗传纯度的测定及遗传关系确定第十六章 安全性导致转基因工程安全性内在原因1、 基因沉默 基因丢失 基因抑制 插入失活 突变2、 插入的基因问题，过敏基因，基因的稳定性，标记基因导致转基因工程安全性外在原因1）社会伦理 2）其他因素