糖及其代谢物的测定

第八章 糖及其代谢物的测定第一节 血清 (浆)葡萄糖测定血液中的葡萄糖称为血糖。 血糖测定是临床生化检验中历史最久、 占日常工作量比重较 大的项目之一。过去测定血糖多采用全血，但目前多采用血清或血浆。测定血糖的方法很多， 可分为三大类：氧化还原法、缩合法及酶法。国际上推荐的参考方法是已糖激酶法，但试剂 比较昂贵，不适用于常规分析。我国已淘汰氧化还原法，推荐的方法是葡萄糖氧化酶法，而 目前有些基层单位仍沿用邻甲苯胺法。实验 39 葡萄糖氧化酶法测定血清(浆)葡萄糖【原理】葡萄糖氧化酶(glucose oxidase GOD)利用氧和水将葡萄糖氧化为葡萄糖酸，并释放过氧化氢。过氧化物酶(peroxidase, POD)在色原性氧受体存在时将过氧化氢分解为水 和氧，并使色原性氧受体 4-氨基安替比林和酚去氢缩合为红色醌类化合物，即Trinder 反应。红色醌类化合物的生成量与葡萄糖含量成正比。【试剂】10.1mol/L 磷酸盐缓冲液 (pH7.0) 称取无水磷酸氢二钠 8.67g 及无水磷酸二氢钾 5.3g 溶于蒸馏水800ml中，用1mol/L氢氧化钠(或1mol/L盐酸)调pH至7.0,用蒸馏水定容至1L。2 酶试剂 称取过氧化物酶1 200U,葡萄糖氧化酶1 200U, 4-氨基安替比林10mg，叠 氮钠100mg,溶于磷酸盐缓冲液80ml中，用1 mol/L NaOH调pH至7.0,用磷酸盐缓冲液定 容至100ml，置4C保存，可稳定3个月。3 酚溶液 称取重蒸馏酚100mg溶于蒸馏水100ml中，用棕色瓶贮存。4 酶酚混合试剂 酶试剂及酚溶液等量混合，4C可以存放1个月。5. 12mmol/L苯甲酸溶液 溶解苯甲酸1.4g于蒸馏水约800ml中，加温助溶，冷却后加 蒸馏水定容至 l L。6. 100mmol/L葡萄糖标准贮存液称取已干燥恒重的无水葡萄糖 1.802g,溶于12mmol/L 苯甲酸溶液约70ml中，以12mmol/L苯甲酸溶液定容至100ml。2h以后方可使用。7. 5mmol/L 葡萄糖标准应用液 吸取葡萄糖标准贮存液 5.0ml 放于 100ml 容量瓶中，用 12mmol/L 苯甲酸溶液稀释至刻度，混匀。【操作步骤】1 自动分析法 按仪器说明书的要求进行测定。2 手工操作法取试管3支，按表8-1操作。表8-1葡萄糖氧化酶法测血糖操作步骤加入物(ml)空白管标准管测定管血清一一0.02葡萄糖标准应用液一0.02一蒸馏水0.02一一酶酚混合试剂3.03.03.0混匀，置37C水浴中，保温15min,在波长505nm处比色，以空白管调零，读取标准管 及测定管吸光度。【计算】测定管吸光度 _血清葡萄糖(mmo|/L)二标准管吸光度5空腹血清葡萄糖为3.896.11mmol/L。【参考范围】【临床意义】1 生理性高血糖可见摄入高糖食物后，或情绪紧张肾上腺分泌增加时。2 病理性高血糖(1) 糖尿病：病理性高血糖常见于胰岛素绝对或相对不足的糖尿病患者。(2) 内分泌腺功能障碍：甲状腺功能亢进，肾上腺皮质功能及髓质功能亢进。引起的各 种对抗胰岛素的激素分泌过多也会出现高血糖。注意升高血糖的激素增多引起的高血糖，现 已归入特异性糖尿病中。(3) 颅内压增高：颅内压增高刺激血糖中枢，如颅外伤、颅内出血、脑膜炎等。(4) 脱水引起的高血糖：如呕吐、腹泻和高热等也可使血糖轻度增高。3 生理性低血糖见于饥饿和剧烈运动。4 病理性低血糖(特发性功能性低血糖最多见，依次是药源性、肝源性、胰岛素瘤等)(1) 胰岛B细胞增生或胰岛B细胞瘤等，使胰岛素分泌过多。(2) 对抗胰岛素的激素分泌不足，如垂体前叶功能减退、肾上腺皮质功能减退和甲状腺功能减退而使生长素、肾上腺皮质激素分泌减少(3) 严重肝病患者，由于肝脏储存糖原及糖异生等功能低下，肝脏不能有效地调节血糖。 【注意事项】1 葡萄糖氧化酶对B -D葡萄糖高度特异，溶液中的葡萄糖约 36%为a型，64%为B型。 葡萄糖的完全氧化需要a型到B型的变旋反应。国外某些商品葡萄糖氧化酶试剂盒含有葡萄 糖变旋酶，可加速这一反应，但在终点法中，延长孵育时间可达到完成自发变旋过程。新配 制的葡萄糖标准液主要是a型，故须放置2h以上(最好过夜)，待变旋平衡后方可应用。2葡萄糖氧化酶法可直接测定脑脊液葡萄糖含量，但不能直接测定尿液葡萄糖含量。因 为尿液中尿酸等干扰物质浓度过高，可干扰过氧化物酶反应，造成结果假性偏低。3. 测定标本以草酸钾-氟化钠为抗凝剂的血浆较好。取草酸钾 6g,氟化钠4g。加水溶 解至100ml。吸取0.1ml到试管内，在80C以下烤干使用，可使 23ml血液在34天内不 凝固并抑制糖分解。4. 本法用血量甚微，操作中应直接加标本至试剂中，再吸试剂反复冲洗吸管，以保证结 果可靠。5. 严重黄疽、溶血及乳糜样血清应先制备无蛋白血滤液，然后再进行测定。【评价】 线性范围至少可达22.24mmol/L,回收率94%105%，批内CV为0.7%2.0%。 批间 CV 为 2%左右，日间 CV 为 2%3%。葡萄糖氧化酶法与己糖激酶法比较， 73份标本葡 萄糖氧化酶法均值为8.31mmol/L，已糖激酶法均值8.21mmol/L，相关系数为0.9986,回归方 程 y=1.0026x2.29。本法测定葡萄糖非常特异， 从原理反应式中可知第一步是特异反应， 第二步特异性较差。 误差往往发生在反应的第二步。一些还原性物质如尿酸、维生素 C、胆红素和谷胱甘肽等， 可与色原性物质竞争过氧化氢，从而消耗反应过程中所产生的过氧化氢，产生竞争性抑制， 使测定结果偏低。然而，在本法的测定条件下，溶血标本血红蛋白的浓度达10g/L，黄疽标本胆红素浓度达342卩mol /L ,维生素C小于30mg/L，均不影响测定结果。氟化钠浓度达 2g/L 不干扰测定结果。标本中含尿素浓度达46.7mmol/L，尿酸浓度达2.95mmol/L，肌酐浓度达4.42mmol/L。半胱氨酸浓度达 3.30mmol/L，甘油三酯浓度达 5.6mmol/L，胆固醇4.40 mmol/L , 对测定结果均无显著影响。左旋多巴100mg/L，维生素C 5mg/L以上，谷胱甘肽100mg/L时，可引起负误差；半胱氨酸达 10mmol/L 时，产生相当 0.72mmol/L 葡萄糖的正误差实验40邻甲苯胺法测定血清（浆）葡萄糖【原理】在热的醋酸溶液中，葡萄糖醛基与邻甲苯胺缩合、脱水，生成希夫氏碱（Schiffbase,经分子重排生成蓝绿色化合物，其颜色深浅在一定范围内与血糖浓度成正比。缩合脱水邻甲苯胺+葡萄糖葡萄糖基胺希夫氏碱 蓝绿色化合物【试剂】1.0.38mol/L硼酸溶液 称取硼酸24g,溶于蒸馏水800ml 中,再用蒸馏水定容至1 000ml, 摇匀即可。2 邻甲苯胺试剂 称取硫脲（AR）1.5g，溶于冰醋酸（AR）700ml中。将此液转入1 L容量 瓶内，加邻甲苯胺60ml，0.38mol/L硼酸溶液100ml，用冰醋酸定容至刻度。此溶液应置棕色 瓶内室温保存，至少可应用 2个月。新配制试剂应放置24h后待“老化”使用，否则反应产 物的吸光度低。3. 100mmol/L葡萄糖标准贮存液见实验39。4. 5mmol/L葡萄糖标准应用液见实验39。5. 0.3mol/L三氯醋酸溶液称取三氯醋酸5g，溶于蒸馏水70ml中，然后用蒸馏水定容 至100ml，混匀即可。【操作步骤】1 血清、血浆、脑脊液及清亮的胸腹水按表8-2操作。表8-2邻甲苯胺法操作步骤加入物（ml）空白管标准管测定管蒸馏水0.1一一葡萄糖标准应用液一0.1一血清（血浆、脑脊液）一一0.1邻甲苯胺试剂3.03.03.0混匀，置沸水中煮沸5min，取出置冷水中冷却3min，在630nm处比色，以空白管调零， 读取各管吸光度。2严重黄疸、溶血及乳糜样血清制备无蛋白血滤液：取血清0.2ml，加入0.3mol/L三氯醋酸溶液l.8ml，混匀，静置5min，离心5min,取上清液按表8-3操作表8-3溶血、脂浊、黄疸血清操作步骤加入物（ml）空白管标准管测定管0.3mol/L三氯醋酸溶液1.00.9一葡萄糖标准应用液一0.1一无蛋白血滤液一一1.0邻甲苯胺试剂5.05.05.0混匀，置沸水浴中煮沸12min,取出置自来水中冷却3min，在波长630nm处比色，以空 白管调零，读取各管吸光度。【计算】测定管吸光度血清匍萄糖（mmol/L ）标准管吸管度53.89 6.11mmol/L。【参考范围】见实验39。【临床意义】【注意事项】1 邻甲苯胺为浅黄色油状液体，易氧化。配制前宜重蒸馏，收集 199201C的馏出部 分，此部分馏出液应为无色或浅黄色， 然后加入盐酸经胺（1g/L）防止氧化，置棕色瓶密封避光 保存。2邻甲苯胺在冰醋酸中并不十分稳定，易氧化产生棕色物质而干扰比色，故在邻甲苯胺 试剂中加入硫脲，使试剂有抗氧化作用，减少棕色干扰，增加试剂的稳定性，降低空白管的 吸光度，并有一定的增色效应。3硼酸与a-葡萄糖的羟基结合，能促进葡萄糖转变醛式构型，增加反应的活性。4沸水浴时沸水一定要盖过管内的液面，否则温度不均匀，影响显色。5此法受煮沸时间、比色时间、试剂存放时间等因素的影响。一般不宜以校正曲线法进 行计算，故每次应同时作标准管。6最终反应液偶尔会产生混浊，最常见原因是高脂血症。此时，可向显色液3ml中加入异丙醇1.5ml，充分混匀。溶解脂质可消除混浊，所测吸光度乘以1.5。注射右旋糖酐时，由于右旋糖酐不溶于邻甲苯胺试剂而产生混浊。冷水浴太冷时亦会出现混浊。【评价】1 准确度 回收率98.6%99.6%。葡萄糖标准液在16.65mmol/L范围以内时，测得值与真值的相关系数为0.9996与己糖激酶(HK)法比较，结果十分相近；y(HK法戸1.03x 0.8(mg/dl)。邻甲苯胺法的结 果略高于酶法，但差异并不明显。2线性范围 可达 30.8mmol/L。3精密度 日内 CV2% 左右，日间 CV 不大于 4%。4特异性和干扰 邻甲苯胺法较 Folin-Wu 法特异，但不及酶法。D-甘露糖能以相同的反应速率与邻甲苯胺试剂发生反应，产生与葡萄糖相似的吸收光谱，造成正误差。果糖和戊糖与邻甲苯胺试剂发生反应，分别在 375nm 和 480nm 处产生吸收峰。 乳糖、麦芽糖和阿拉伯糖也可造成不同程度的干扰。但在正常情况下，血中这些糖含量甚微， 对测定结果影响不大。轻度溶血无干扰，但1g/L Hb能使结果增高0.11mmol/L。胆红素171卩mol/L无影响。浓 度达342卩mol/L时测定结果偏高为1.39mmol/L。重度脂血可使反应产生混浊，向最终反应液加异丙醇可消除。实验 41 己糖激酶法测定血清(浆)葡萄糖【原理】葡萄糖和三磷酸腺苷(ATP)在己糖激酶(hexokinase, HK)催化下，发生磷酸化反应，生成葡萄糖-6-磷酸(G-6-P)与二磷酸腺苷(ADP)。G-6-P在葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G-6-PD) 的催化下脱氢，生成6-磷酸葡萄糖酸(6-PGA)，同时使NADP+还原成NADPH + H+，还原型 NADPH的生成速度与葡萄糖浓度成正比，在波长340nm监测吸光度升高速率，可计算血清中葡萄糖浓度。【试剂】l 酶混合试剂 己糖激酶测定葡萄糖，多用试剂盒，目前国外生产试剂盒的厂家很多， 但酶混合试剂的配方大同小异。酶混合试剂的组成成分与浓度如下：三乙醇胺盐酸缓冲液 (pH7.5)50mmol/LMgSO42mmol/LATP2mmol/LNADP2mmol/LHK 1 500U/LG-6-PD2 500U/L根据试剂盒说明书配制，保存于 4C冰箱。2100mmol/L 葡萄糖标准贮存液 见实验 393. 5mmol/L葡萄糖标准应用液见实验39【操作】1. 速率法 使用自动分析仪器。仪器的操作程序，测定的主要参数（如系数、延迟时间、监测时间及次数、波长、被测样品和试剂用量、温度等）须按说明书进行。2. 终点测定法按表8-4加入样品及试剂：表8-4己糖激酶法操作步骤加入物（ml）空白管标准管对照管测定管血清一一0.020.02葡萄糖标准应用液一0.02一一生理盐水0.02一2.0一酶混合试剂2.02.0一2.0（2）以上各管充分混合，在37C水浴，准确放置10min，用蒸馏水调零，用5mm径比色皿,在340nm波长处读取各管吸光度【计算】1. 速率法葡萄糖(mmol/L )测定管 A /min -空白管 A /min 标准管 A /min -空白管 A /min空白管以蒸馏水代替血清葡萄糖（A测定一A对照一A空白mmol/L ）52.终点法【参考范围】【临床意义】【注意事项】A标准一A空白3.89 6.11mmol/L（空腹）。见实验39。1. HK是关键的工具酶，必须使用高纯度产品，其比活性应 140 IU/mg酶蛋白（25C）。 杂酶G-6-DP、谷胱甘肽还原酶、6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶均应v 0.01%HK活性单位，磷酸葡萄 糖异构酶v 0.02%HK活性单位。HK的最适pH6.09.0, pI为4.54.8。Mg2+为HK的激活 剂，EDTA为抑制剂。2. G-6-PD亦是关键的工具酶，其纯度要求高，比活性应140 IU/mg酶蛋白（25C）。杂酶磷酸葡萄糖变位酶和6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶均应v 0.01% G-6-PD活性单位，谷胱甘肽还原 酶和磷酸葡萄糖异构酶均应V 0.02% G-6-PD活性单位。以NADP+为辅酶的最适pH 8.5，以 NAD+为辅酶的最适pH为7.8。3. NAD+ 或 NADP+的纯度要求达98%以上。4对整个试剂的要求(1) 试剂空白在保温30min时吸光度小于0.1,保温6min与30min间吸光度变化V 0.01。(2) 33.3mmol/L葡萄糖标准液在保温 30min后的吸光度在1.61.8之间，保温8min与 30min吸光度之差V 0.01。5.如用耐热的葡萄糖激酶代替 HK ，即可提高专一性，又可提高稳定性。 【评价】1. 线性范围 可达33.31mmol/L，最高达40.8mmol/L。2. 准确度 回收率 99.4%101.6%，平均为 100.5%(样品含量为 2.22、4. 86、8.34mmol/L) 。3. 精密度 日内CV为0.6%1.0%,日间CV为1.3%左右。4. 方法学比较 与质谱法比较，y=1.02x 0.5。与GOD-POD法比较，r=0.998, y=1.01x 0.190。5. 特异性和干扰HK 法最大优点是特异性相当高，干扰少。HK对D-葡萄糖、D-甘露糖、D-果糖、D-葡糖胺均有催化作用，来源于牛脑和酵母的HK的最适底物是D-甘露糖和D-葡萄糖。但G-6-PD的最适底物是G-6-P，对G-6-P具有高度 专一性，对 6-磷酸果糖和 6-磷酸甘露糖不起作用，因此 HK 法的特异性很强。轻度溶血、脂血、黄疽、维生素 C、氟化钠、肝素、D-甘露糖、草酸盐、谷胱甘肽及某 些药物如左旋多巴、肼苯哒嗪等均无干扰。严重溶血(Hb 25.12g/L)致使红细胞内有机磷酸酯及一些酶类释放，消耗NADP+,可使葡萄糖测定值下降 6.6%32%。第二节 血清 (浆)糖化蛋白的测定葡萄糖可以和体内多种蛋白质中的氨基不可逆地以共价键结合，这个过程不需要酶的参与，反应速度主要取决于葡萄糖的浓度。这种被葡萄糖糖化的蛋白主要存在于糖尿病或其他高血糖患者中，糖化过程经常缓慢地进行，一旦形成，不再解离。故对血糖或尿糖波动较大 的患者来说，采用糖化蛋白来诊断或追踪病情的发展有其独特的临床意义，它可以反映较长 时期以来的平均血糖浓度。临床上测定的糖化蛋白主要有糖化血红蛋白(glycohemoglubin，GHb）和糖化血清蛋白（glycated serum protein GSP）。测定糖化蛋白的方法有比色法、电泳法、 等电聚焦法、离子交换层析法、高效液相层析法、亲和层析法、免疫化学法、毛细管电泳法 等。国内以比色法、离子交换层析法及电泳法较常用。实验 42 微柱法分离糖化血红蛋白【原理】 带负电荷的Bio-Rex 70阳离子交换树脂与带正电荷的 HbA及HbA1有亲和力， 但由于HbA1的两个B链N-末端正电荷被糖基清除，正电荷较HbA 少,二者对树脂的亲和力 不同。用 pH6.7 磷酸盐缓冲液可首先将带正电荷较少、吸附力较弱的 HbA1 洗脱下来，用分 光光度计测定洗脱液中的HbA1占总Hb的百分数。【试剂】1. 0.2mol/L磷酸氢二钠溶液称取无水Na2HPO4 28.369g,溶于蒸馏水中并定容至1L。2. 0.2mol/L磷酸二氢钠溶液称取NaH2PO42出0 31.206g,溶于蒸馏水中并定容至1L。3. 溶血剂 取0.2mol/L磷酸二氢钠25ml，加Triton X-100 100mg ,加蒸馏水定容至100ml。4 .磷酸盐缓冲液（pH6.7） 取0.2mol/L磷酸氢二钠100ml, 0.2mol/L磷酸二氢钠150ml, 加蒸馏水定容至 1 L。5 .磷酸盐缓冲液（pH6.4） 取0.2mol/L磷酸氢二钠300ml, 0.2mol/L磷酸二氢钠700ml, 加蒸馏水300ml，混匀即成。6. Bio-Rex 70阳离子交换树脂 200400目，钠型，分析纯级。【操作】1. 树脂处理 称取树脂10g,加0.1mol/L氢氧化钠溶液30ml，搅匀，置室温30min，间 常搅拌23次。然后加浓盐酸数滴，调至 pH6.7，弃去上清液。用蒸馏水约 50ml洗1次， 用磷酸盐缓冲液（pH6.4）洗2次，再用磷酸盐缓冲液（pH6.7）洗4次即可。2. 装柱 将树脂加磷酸盐缓冲液（pH6.7）搅匀，用毛细滴管加入塑料微柱内，使树脂床高 度达 3 4cm 即可，树脂床应均匀，无气泡无断层即可。3 .血红蛋白溶液的制备 取EDTA抗凝血或毛细管血20卩l，加入生理盐水2.0ml中摇 匀，离心弃上清液，仅留下细胞。加溶血剂 0.3ml，摇匀，置37T水浴中15min，以除去不稳 定的 HbA1。4. 柱的准备 将微柱摇动使树脂混悬，然后去掉上下盖，将柱插入1.5cm x 15cm的试 管中，让柱内缓冲液完全流出。5 .上样 用微量加样器取血红蛋白溶液100卩l，加至微柱内树脂床上，待其完全进入树脂床后，将柱移入另一支1.5cmx 15cm的试管中。6洗脱 取磷酸盐缓冲液(pH6.7)3ml缓缓加至树脂床上，注意勿冲动树脂。收集洗脱液, 此即为HbAi(测定)。7 .对照 取上述血红蛋白溶液50卩l，加蒸馏水7.5ml，摇匀，此即为总Hb管。8 比色 以蒸馏水作空白，于415nm波长测定各管吸光度。9 .柱的清洗 用过的柱先加磷酸盐缓冲液(pH6.4)3ml，使Hb全部洗下、再用磷酸盐缓 冲液(pH6.7)洗3次，每次3ml。最后加磷酸盐缓冲液(pH6.7) 3ml，加上下盖，保存备用。【计算】HbAi%测定管吸光度100%对照管吸光度 5【参考范围】 HbA1： 6.59% 一 0.69%。【临床意义】糖化血红蛋白测定用于评定糖尿病的控制程度，当糖尿病控制不佳时，糖化血红蛋白浓度可高至正常 2倍以上。因为糖化血红蛋白是血红蛋白生成后与糖类经非酶 促结合而成的。它的合成过程是缓慢的，而且是相对不可逆的，持续于红细胞120天生命期中，其合成速率与红细胞所处环境中糖的浓度成正比。因此，糖化血红蛋白所占比率能反映 测定前12个月内平均血糖水平，现已成为反映糖尿病较长时间血糖控制水平的良好指标。【注意事项】1. 层析时一般在28C较为适宜，冬季应将柱置于 28C温箱中洗脱。2. HbA1不能和HbF、HbH及Hb Bart分开，有前述异常血红蛋白病者不宜用此方法。3. 标本置室温超过24h可使结果增高，贮4C冰箱可稳定5天。4. 抗凝剂EDTA和氧化物不影响结果，肝素可使结果增高。实验43果糖胺法测定糖化血清蛋白【原理】 血清蛋白质分子中的末端氨基能与葡萄糖经非酶促反应生成高分子酮胺结构。其生成量直接与血糖浓度有关，并且和糖化血红蛋白高度相关。在碱性溶液中，这种酮胺结 构与硝基四氮唑蓝(NBT)发生还原反应，产生紫红色甲臢然后以具有同样氨基-1-脱氧-2-酮糖结构的1-脱氧-1-吗啉果糖(DMF)为标准同时操作，作比色测定。【试剂】1. 0.1mol/L碳酸盐缓冲液(pH10.8)无水碳酸钠9.54g,碳酸氢钠0.84g,溶于蒸馏水并定容至1 000ml。2. O.11mmol/L NBT试剂 称取氯化硝基四氮唑蓝100mg,用上述缓冲液溶解并定容至1 000ml。置冰箱保存，至少可稳定 3个月。3. 40g/L牛血清白蛋白溶液。4. 4mmol/L DMF标准液 称取DMF 99.6mg，溶于40g/L牛血清白蛋白溶液100ml中。 【操作】1 .样本的测定按表8-5操作。2.表8-5 血清(血浆)DMF测定步骤加入物(ml)空白管待测管血清(血浆)一0.1蒸馏水0.1一NBT（37C 预温）4.04.0混匀，置37C水浴中15min,取出试管在流水中冷却 15min(v25C),于550nm波长处 空白管调零，读取测定管吸光度，从校正曲线上查出DMF浓度。2. 校正曲线制备取4mmol/L DMF标准液用牛血清白蛋白溶液(40g/L)稀释成1、2、3、4mmol/L，并以40g/L 牛血清白蛋白为空白，与测定管同样操作，读得各浓度 DMF相应的吸光度。以DMF浓度为 横坐标，吸光度为纵坐标，制成校正曲线。糖化血清蛋白浓度在 4mmol/L内与吸光度呈线性 关系。【参考范围】1.9 一 0.25mmol/L DMF。【临床意义】1. 血清蛋白半寿期较短(血清白蛋白17天，总蛋白30天，Hb为120天)，本试验可有效 地反映患者过去12周内的血糖控制水平。2. 本试验不受临时血糖浓度波动的影响， 对糖尿病人的诊断和较长时间血糖控制水平的 观察，以及同一患者前后连续检测结果的比较具有一定的价值。【注意事项】1. 必须严格控制pH值、反应温度及反应时间。2. 37E加温15min时间需正确掌握并立即冷却，否则颜色将继续加深影响结果。所以在 测定时宜加测已知浓度DMF的质控管，以观察与校正曲线的符合程度。有人认为改用加入 10%乙酸0.1ml，比用物理冷却终止效果更佳，可使 pH降至7.0以下而有效地终止反应。3. DMF的合成方法 称取无水D-葡萄糖90g(0.5mol)，吗啡啉58g(0.67mol),加蒸馏水1 L,溶解后在6070C水浴上搅拌，开始为黄色糊状物，后颜色逐渐加深。20min后，移去水浴，缓慢地加入丙二酸18g(0.17mol)。整个加入过程需在10min以上。再置水浴并使温度 上升至80E，不断搅拌，颜色逐渐由黄绿色转变为琥珀色。10min后，加入无水乙醇70ml，维持75E 30min，再加入丙酮70ml。此时可见到结晶析出，此即为 DMF。放4C冰箱过夜， 收集结晶，并用无水乙醇重结晶3次，使产物脱色纯化，干燥备用。熔点146147E，分子式 C10H19O6N，分子量 249。4. 另外现已有酮化氨基酸氧化酶法，该法的准确度和精密度优于果糖胺法。第三节 血液其他糖类及糖代谢产物的测定实验 44 半乳糖氧化酶法测定半乳糖【原理】 在半乳糖氧化酶催化下半乳糖被氧化生成半乳已二醛糖 (galactohexodialdose) 和过氧化氢。过氧化氢由偶联的过氧化物酶催化释放出氧，使色原性氧受体 (邻联茴香胺 )被 氧化而呈色。【试剂】1. 0.02mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.6)称取磷酸二氢钾1.06g和磷酸氢二钠1.74g,溶解于 蒸馏水 950ml 中，调 pH 至 7.0，然后加蒸馏定容至 1 000ml。2半乳糖氧化酶溶液称取半乳糖氧化酶干粉约1mg(相当于30U)置于乳钵中，加缓冲液研磨助溶，最后加缓冲液至 50ml，过滤。此液可在冰箱保存数天。3显色剂 将POD干粉10mg(相当于90U)溶解于缓冲液500ml中，加入1%邻联茴香 胺甲醇溶液5ml，置冰箱保存。如溶液颜色变深，空白管吸光度增高则应弃去，重配新液。4. 30%(V/V) 硫酸溶液 小心加浓硫酸 300ml 于蒸馏水 700ml 中。5. 0.175mol/L硫酸锌溶液 称取结晶硫酸锌(ZnSO4 7H2O)50g，用蒸馏水溶解并定容至1 000ml。6. 0.15mol/L氢氧化钡溶液 称取氢氧化钡Ba(OH)2 8H2O47g，溶于新蒸馏或刚煮沸 的去离子水中，然后定容至1 000ml。如溶液出现混浊，则将瓶口塞紧，在室温中放置数日， 取上清液应用。氢氧化钡能吸收空气中的二氧化碳生成碳酸钡沉淀，故应避免与空气接触。7. 56mmol/L半乳糖标准贮存液称取D( +)半乳糖1 g，溶解于蒸馏水并定容至100ml。8. 11.2mmol/L 半乳糖标准应用液 取贮存液 2ml 用蒸馏水稀释至 100ml。【操作步骤】1 取蒸馏水0.5ml、血清0.1ml、0.15mol/L氢氧化钡0.2ml，混匀，力卩0.175mol/L硫酸 锌0.2ml，混匀，4 000r/min离心5min,制成1/10的去蛋白滤液。3 按表8-6加入试剂。4.表8-6半乳糖酶法测定半乳糖步骤加入物(ml)空白管标准管测定管显色剂1.01.01.0半乳糖氧化酶试剂1.01.01.0去蛋白血滤液一一0.5标准应用液一0.5一蒸馏水0.5一一混匀，37 r水浴，30mi n30%硫酸溶液2.52.52.5混匀，用空白管调零，在波长 530nm处读取各管吸光度。【计算】测定管吸光度血半乳糖浓度的肌宀标准管吸光度12 1。【参考范围】【临床意义】成人：0 mmol/L;儿童：v 1.1mmol/L。正常人耐量指数不超过 8.9mmol/L。正常成人血液及尿中不合或仅有微量半乳糖。哺乳期妇女及新生儿血液及尿中有时可有少量半乳糖。先天性半乳糖代谢障碍的患者血液及尿中可出现半乳糖。临床上测定血液半乳糖多用在作半乳糖耐量试验。正常人耐量指数不超过8.9mmol/L，肝脏病患者半乳糖耐量指数增加，传染性肝炎及中毒性肝炎，耐量指数可升高至2833mmol/L，随病情好转耐量指数亦降低。肝硬化患者耐量指数可为16.222.2mmol/L或更高。甲状腺功能亢进时半乳糖指数亦可增高。【注意事项】1. 口服半乳糖耐量试验的具体操作步骤受试者经一夜禁食后，次晨取空腹血测定半乳糖作试前空白对照。然后口服半乳糖 40g(溶于250ml水中)。服糖后30min、1 h及2h分别取 血测定半乳糖浓度。Maclagan提出判断结果的标准是将各次测定结果的总和作为一个指数。 正常人耐量指数不超过 8.9mmol/L。2. 过氧化物酶催化的反应易受巯基化合物、尿酸、维生素C及其他含氧化色素的物质 干扰，在本法中用碱性去蛋白的方法可去除这些干扰物质，而用酸性去蛋白则巯基化合物、 尿酸不能被破坏。3半乳糖氧化酶还能氧化含半乳糖的寡糖和糖蛋白，且反应速率比氧化半乳糖还高。但 在大多数体液中这类成分很少发现，因此可认为本测定的专一性是很好的。实验45比色法测定全血乳酸【原理】将血液除去蛋白质后于无蛋白上清液中加入硫酸铜和氢氧化钙，以除去葡萄糖和其他干扰物质。取经处理过的溶液同硫酸一起加热，使乳酸氧化成乙醛，后者与对-羟基联苯作用产生紫色缩合产物。其紫色缩合产物生成量与血液中乳酸浓度有关。将标准与样品 同样处理，可求出血液中乳酸含量。在有铜离子存在时，可使颜色反应的强度增强。【试剂】1 三氯醋酸贮存液称取三氯醋酸结晶100g,加少量蒸馏水使溶解，再加蒸馏水定容至100ml，贮于磨口瓶中，可长期保存。2 三氯醋酸应用液取三氯醋酸贮存液10ml，用蒸馏水稀释至100ml，每周新鲜配制。3. 200g/L硫酸铜溶液 称取硫酸铜结晶(CuSO4 5H2O)20g，溶于蒸馏水中，用蒸馏水 定容至100ml。4. 40g/L硫酸铜溶液 取200g/L硫酸铜溶液20ml，用蒸馏水定容至100ml。5 氢氧化钙粉末(AR)。6浓硫酸(AR，无铁)应用滴定管加注，滴定管上应装有吸潮装置，同时，滴定管的活 塞不应含有任何润滑油，可用少量浓硫酸润滑。7. 对-羟基联苯试剂 在250ml烧杯中加入对-羟基联苯(C6H5 C6H4OH)1.5g,加2.5mol/L 氢氧化钠溶液5ml和蒸馏水10ml，稍微加热。不断搅拌，直至完全溶解，然后加蒸馏水稀释 定容至100ml，贮存于棕色瓶中置室温可稳定 6个月。当试剂空白的吸光度增加很多时，此 试剂应弃去。8. 1mmol/L乳酸标准液 精确称取L-乳酸锂9.6mg或DL-乳酸锂19.2mg,以少量蒸馏 水溶解，加浓硫酸25卩l，用蒸馏水定容至100ml。4C可长期保存。【操作步骤】1. 血样乳酸浓度的测定(1) 取有塞15ml离心管2支，分别标明测定和试剂空白，每管各加入三氯醋酸应用液 4.5ml，于测定管中逐滴加入血液0.5ml，边加边摇，加塞用力振摇30s。于试剂空白管中加入 蒸馏水0.5ml，塞好，混匀。(2) 于室温放置5min后，5 000r/min离心3min(不能过滤)。(3) 分别取上述两管上清液 2ml 放入相应标记的 15ml 有塞离心管中，各加 200g/L 硫酸 铜溶液1ml，混匀。加蒸馏水定容至10ml，加塞，混匀。加氢氧化钙粉末约1 g,加塞，用力 振摇30s,如果混合物不带亮蓝色，则应多加一些氢氧化钙。(4) 在室温放置30min，每隔10min振摇一次。然后5 000r/min离心5min(不能过滤)。(5) 分别吸取上清液1 ml放入相应标记的18mmx 150mm的试管中，上清液中不能混有 任何微小颗粒。每管各加40g/L硫酸铜溶液0.05ml，混匀，在不断振摇的情况下各加浓硫酸 8ml，用力振摇以充分混匀。 将试管置沸水中加热5min,然后取出在流动自来水中冷却至 20C左右，加入对-羟基 联苯液0.1 ml，注意应使试剂直接加入酸中(勿沿管壁)，同时应用力振摇以混匀沉淀物。将试 管置30C水浴中至少30min,每10min应振摇试管一次，使沉淀的试剂再分散，溶液应显紫 蓝色。此时如显红紫色表明温度太高，必须重作。(7) 放入沸水浴中准确90s，此时溶液应完全清澈，显红紫色。取出，在流动自来水中冷 却到室温。(8) 以试剂空白管调零，在 565nm 波长下测得样品管的吸光度，查校正曲线，可求出血 样中乳酸的含量。2校正曲线的制备(1) 取 6个 10 ml 容量瓶分别加入 1 mmol/L 乳酸标准液 0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 ml。 用蒸馏水定容至 10ml 刻度，混匀。(2) 取6支15ml有塞离心管，分别加入上述标准液1ml，各加200g/L硫酸铜溶液1 ml，混匀。加蒸馏水定容至10ml刻度，加塞，混匀，加氢氧化钙粉末约1g，加塞，用力振摇30s。(3) 以下按照上述第(4)(8)步骤操作。(4) 以乳酸浓度为横坐标，以吸光度为纵坐标绘制校正曲线。其浓度分别相当于全血乳酸 0、1 、2、3、4、5mmol/L 。【参考范围】 静脉全血乳酸含量为 0.552.2 mmol/L (在安静状态时 )。【临床意义】1当剧烈运动时血液乳酸可达 11.0 mmol/L 以上，恢复时将迅速降低。2 在病理情况下，血乳酸可上升为 226mmol/L，血中增高的乳酸取代碳酸氢盐，通常 在血乳酸超过 7mmol/L 时，临床上出现乳酸性酸中毒。不论由于情绪或呼吸障碍引起的低血 氧，血中乳酸增加比丙酮酸明显。运动、严重贫血、急性喘息、抽搐后可使血乳酸中度增加。休克、周围循环衰竭、分流手术和心脏停搏时血乳酸明显增高。3糖尿病酮症酸中毒昏迷时，血乳酸增高，但一般不超过7mmol/L ，而在非酮性糖尿病酸中毒患者，血乳酸可明显增高，特别多见于口服降糖灵治疗的患者。4严重肝脏病时，可引起血乳酸增加，尿毒症患者亦常伴有乳酸酸中毒。【注意事项】1应强调在安静状态时抽血并尽快送检。 当收到血液标本后， 立即制备无蛋白血上清液。2应采用含氟化钠的抗凝剂可防止血液标本在放置期间葡萄糖酵解转变成乳酸。3必须用有玻璃塞的试管进行混合或振摇。4 加氢氧化钙时可用一个约1g容量的药匙加，不必准确称量。5本测定所用硫酸应预先用乳酸标准液按测定操作进行试验，如显色能达到要求，可作 乳酸测定专用试剂；如显色极淡，应另选合适的硫酸。6当温度超过35C时对-羟基联苯在硫酸中很快消失，故在加入此试剂前应将试管充分 冷却。对 -羟基联苯溶液与酸接触时即产生沉淀，故应滴加在液面上并立即摇匀，使沉淀物分 散成小颗粒，在30min放置期间，应不时摇动试管，使颗粒渐渐消散，最后加热90s，使颗粒完全消失，液体呈透明。加热时间应控制在12min之间，显色后颜色稳定，1 h时内无变化， 3 h 约降低 5%。7该法准确精密而特异，但操作麻烦和费时。此外还有血浆乳酸测定的氧化酶法，该法 无需制备无蛋白滤液，且在 550nm 检测，故可手工操作，也可自动化分析。实验 46 乳酸脱氢酶法测定全血乳酸【原理】 乳酸在乳酸脱氢酶 (LD) 催化下脱氢生成丙酮酸，氧化型 NAD +接受氢转变成 还原型 NADH 。加入硫酸肼可捕获丙酮酸促进反应完成。生成的 NADH 与乳酸为等量摩尔， 于 340nm 波长测定 NADH 的吸光度，可计算出血液中乳酸含量。【试剂】1. 30g/L偏磷酸(MPA)用少量蒸馏水溶解MPA 3.0g，并定容至100ml，新鲜配制。2. 50g/L偏磷酸(MPA)用少量蒸馏水溶解MPA 5.0g，并定容至100ml，新鲜配制。3. Tris-硫酸肼缓冲液(pH9.6) 称取 Tris 4.79g,硫酸肼 26g，EDTA-Na2 0.93g,加至 1mol/L氢氧化钠溶液350ml中调pH至9.6，再用蒸馏水定容至500ml，4C保存可稳定8天。4. 27mmol/L(20mg/ml) NAD +溶液 按需要量用蒸馏水配制，4C保存可稳定48h。5. LD 溶液 取 LD 原液，用生理盐水稀释成 1 500U/ml。6. 1mmol/L乳酸标准液 精确称取L-乳酸锂9.6mg(或DL-乳酸锂19.2mg)，以少量蒸馏 水溶解，加入浓硫酸25卩l，用蒸馏水定容至100ml, 4C保存可长期稳定【操作步骤】按表8-7加入试剂。表8-7全血乳酸酶法测定操作步骤加入物(ml)空白管标准管测定管Tris-硫酸肼缓冲液2.002.002.00偏磷酸溶液(30g/L)0.10一一乳酸标准液一0.10一无蛋白上清液混匀0.10LD溶液0.030.030.03NAD +溶液0.200.200.20混匀，置室温15min后，于340nm波长处，以空白管调零，读取各管吸光度【计算】乳酸(mmol/L)测定管吸光度 标准管吸光度1.0 DD为稀释因子，见注意事项。也可根据NADH的毫摩尔吸光度按下式计算:2 33 D乳酸(mmol/L)=测定管吸光度I爲.12.33为反应液的总体积(ml) ； 6.22为NADH的毫摩尔吸光度；0.1为上清液体积(ml)。【参考范围】空腹全血乳酸含量为0.51.7mmol/L(50150mg/L)。血浆中乳酸含量约比全血中含量高7%。脑脊液乳酸含量与全血接近。【注意事项】1 标本采集与处理(1)应在空腹及休息状态下抽血。抽血时不用止血带、不用力握拳。如非用止血带不可， 应在穿刺后除去止血带至少等待2min后再抽血。最好用肝素化的注射器抽血，抽取后立即注 入预先称量的含冰冷蛋白沉淀剂的试管中。如用血浆测定，每毫升血用氟化钠10mg及草酸钾2mg抗凝，立即冷却标本，并在15min内离心。（2）抽血前应先将试管编号，称重（Wt）并记录。加入 MPA（50g/L）6ml，再称重（Wm）后，放入冰浴中，每份标本最好作双管分析。抽血后立即注入上述试管中，每管2ml。颠倒混合3次，不可产生气泡，待试管温度与室温平衡后，再称重 （Wb）。静置至少15min后，4 000r/min 离心沉淀15min，上清液必须澄清。计算稀释因子 D。r Wb _WtDWb -Wm2 偏磷酸一般是由偏磷酸（HP03）及偏磷酸钠（NaP03）组成的易变混合物。偏磷酸在水溶 液中形成各种多聚体（HPO3）x。氢离子催化此多聚体水化成正磷酸（HPO3十H2 H3PO4）。正磷 酸不沉淀蛋白质，偏磷酸溶液沉淀蛋白的能力在4C时仅能维持大约1周。3本法不用过氯酸作蛋白沉淀剂。过氯酸不能沉淀粘蛋白，并可干扰丙酮酸的酶法测定 （若需用同一滤液作丙酮酸测定时），使LD的酶促反应变慢。4一般乳酸锂未标明L-或DL-者，均为DL-型，L-型乳酸锂价格昂贵。【评价】本法线性范围为 5.6mmol/L（50mg/dL），回收率101%104%，CVV 5%。严格按取样程序采血，正偏差小，但因线性范围上限低，样品（尤其是那些乳酸浓度中等程度升高的样品）常需适当稀释，并需把这些落在线性范围的稀释倍数用于计算。实验47分光光度法测定全血丙酮酸【原理】丙酮酸在pH7.5的条件下，在乳酸脱氢酶的催化下，接受还原型辅酶I递给的氢，还原为乳酸。这一反应是乳酸测定的逆反应，在pH7.5的条件下，平衡常数极有利于这一逆反应。【试剂】1. 0.75mol/L Tris缓冲液 称取三羟甲基氨基甲烷（Tris）45.4g，溶于蒸馏水并定容至 500ml。2. 13mmol/L NADH溶液 称取还原型辅酶I二钠盐10mg,溶于10g/L碳酸氢钠溶液1 ml中。4C冰箱保存，48h内使用。3. 30g/L偏磷酸溶液 称取偏磷酸3.0g，溶于蒸馏水中，定容至100ml，新鲜配制。4. LD溶液 取LD原液用生理盐水稀释成1 500U/L。5. 0.1mmol/L丙酮酸标准贮存液精确称取丙酮酸钠1.101g,溶于0.1mol/L盐酸中并定 容到100ml，保存于4C冰箱。6. 0.05mmol/L丙酮酸标准应用液临用前取标准贮存液 0.05ml，用30g/L偏磷酸稀释至 100ml。【操作步骤】1 .标本的采集与无蛋白血上清液的制备见实验462 .按表8-8进行操作。表8-8分光光度法测定全血丙酮酸操作步骤加入物（ml）空白管标准管测定管无蛋白上清液一一1.0丙酮酸标准应用液一1.0一30g/L偏磷酸1.0一一Tris缓冲液0.50.50.5NADH溶液0.030.030.033 .混匀，以蒸馏水调零，于340nm波长处测定各管吸光度。4. 每管加入LD溶液0.03ml,混匀，置室温2min后，再读取吸光度，以后每隔1min读 1次吸光度，直至读数稳定。【计算】丙酮酸（mmol/L）测定管一主空白管 .A标准管一.A空白管0.05 D A :读数稳定时的吸光度与未加 LD溶液时的吸光度之差D:稀释因子。丙酮酸（mmol/L） =（ A测定管 A空白管） 156 6.22 1.01.56:反应液总体积（ml）;6.22: NADH的毫摩尔吸光度；1.0:无蛋白上清液的体积（ml）;D:稀释因子。【参考范围】静脉血丙酮酸浓度：0.030.1mmol/L （空腹休息状态下）。【临床意义】1. 当组织严重缺氧时丙酮酸需氧氧化障碍，丙酮酸还原成乳酸，血中乳酸增加，乳酸与 丙酮酸比值增高。乳酸甚至高达25mmol/L，这种极值的出现标志着细胞氧化过程的恶化，并 与显著的呼吸增强、虚弱、疲劳、恍惚及最后昏迷相联系。2. 血液丙酮酸的测定主要用于维生素 B1缺乏症的诊断。维生素B1的焦磷酸酯是丙酮酸 在细胞内进一步氧化分解为乙酰辅酶 A 时的脱羧辅酶。 维生素 B1 缺乏时，体内丙酮酸的氧化 发生障碍，使丙酮酸的含量增加。3糖尿病、充血性心力衰竭、腹泻及其他消化性障碍、某些急性感染及肝脏病变等均可 使血丙酮酸浓度增高。【注意事项】1血中丙酮酸极不稳定，血液抽出后 1min 就见减低。在偏磷酸沉淀蛋白的上清液中的 丙酮酸，置4C可稳定8天。2丙酮酸标准应用液必须每日新鲜配制，因其中丙酮酸会发生聚合，其聚合体的酶促反 应速率与非聚合体不同。3若需求乳酸与丙酮酸比值时，应用全血乳酸测定分光光度法与本法来进行计算。 【评价】 分光光度法测定丙酮酸能适应绝大多数自动分析仪，有较为精密准确的分析 性能，在条件较好的实验室可用于丙酮酸的定量分析。1 准确度将0.080.10mmol/L的丙酮酸标准液加入血浆或血清中再制备除蛋白的上清液，测定回收率为97%104%。2线性范围在 00.25mmol/L 范围内显良好线性。3 精密度丙酮酸标准液为 0.08mmol/L时CV为2.5%。4 特异性和干扰特异性较高，抗干扰能力强。将 0.1卩mol/L a -酮戊二酸、B -羟丁酸、 草酰乙酸、乙酰乙酸、a -酮丁酸和异柠檬酸分别作干扰物，结果表明除 a -酮丁酸产生正干 扰外，其余物质均无干扰。此外，测定血丙酮酸含量还有丙酮酸氧化法。（彭剑雄）