（浙江专版）2019版高考生物一轮复习 第32讲 基因工程学案

第32讲 基因工程章知识内容考试属性及要求考查频率加试基因工程1.工具酶的发现和基因工程的诞生2.基因工程的原理和技术3.基因工程的应用4.活动：提出生活中的疑难问题，设计用基因工程技术解决的方案abac2015年10月第32题(1)(2)(5)(6)(4分)2016年4月第32题(二)(1)(3分)克隆技术5.植物的克隆6.动物的克隆ba2015年10月第32题(4)(2分)2016年4月第32题(二)(1)(2)(4分)2016年10月第32题(二)(1)(2)(3)(7分)胚胎工程7.从受精卵谈起8.胚胎工程aa生态工程9.生态工程的主要类型10.生态工程在农业中的应用11.活动：庭院生态系统的经济效益分析aaa2017年4月第32题(二)(1)(2)(7分)考点基因工程1.基因工程(1)广义概念：把一种生物的遗传物质(细胞核、染色体脱氧核糖核酸等)移到另外一种生物的细胞中去，并使这种遗传物质所带的遗传信息在受体细胞中表达。(2)核心：构建重组DNA分子。(3)基因工程原理：基因重组。(4)理论基础：DNA是生物遗传物质的发现，DNA双螺旋结构的确立以及遗传信息传递方式的认定。(5)技术保障：限制性核酸内切酶、DNA连接酶和质粒载体的发现和运用。2.基因工程的工具(1)限制性核酸内切酶来源：主要从原核生物中分离纯化出来。作用a.特异性识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列。b.切割相应两个核苷酸之间的磷酸二酯键。结果：产生粘性末端或平末端。(2)DNA连接酶作用：将具有相同粘性末端或平末端的两个DNA片段连接在一起，形成磷酸二酯键。(3)载体常用载体质粒：在细菌中独立于拟核之外，为双链环状DNA分子，能自主复制和稳定存在，常含有特殊的抗生素抗性基因作为标记基因，以供目的基因筛选。其他载体：噬菌体、动植物病毒等。3.基因工程的基本操作步骤4.基因工程的应用(1)用于遗传育种：定向变异，目的性强；克服远缘杂交不亲和的障碍。(2)用于疾病治疗：生产基因工程药物，如胰岛素、乙肝疫苗等。基因治疗：向目标细胞中引入正常功能的基因，纠正或补偿基因缺陷，达到治疗的目的。如对B型血友病治疗获得成功。(3)用于生态环境保护1.(201510月浙江选考节选)科研人员拟将已知的花色基因(目的基因)转入矮牵牛的核基因组中，培育新花色的矮牵牛。请回答：(1)为了获得大量的目的基因，将其与含有抗生素抗性基因的质粒DNA形成重组DNA，再与经_(A.氯化钙B.氯化钠C.蔗糖D.葡萄糖)处理的大肠杆菌液混合，使重组DNA进入大肠杆菌。(2)从扩大培养的大肠杆菌中提取含有目的基因的DNA，用_分别切割含目的基因的DNA和农杆菌的Ti质粒，然后用DNA连接酶连接，形成重组DNA并导入农杆菌。(3)提取叶片组织的DNA，采用PCR技术_目的基因，鉴定目的基因是否成功导入。(4)为判断本研究是否达到预期目的，可比较转基因植株和非转基因植株的_性状。解析(1)用氯化钙处理大肠杆菌，使大肠杆菌处于感受态，使重组DNA能够进入大肠杆菌，完成重组DNA的导入。(2)用限制性核酸内切酶分别切割含目的基因的DNA和农杆菌的Ti质粒，然后用DNA连接酶连接，形成重组DNA分子。(3)采用PCR技术可对特定DNA片段进行扩增。(4)检测转基因植物中目的基因的表达情况，可以对转基因植物个体的相应性状变化进行鉴定，本研究中可以比较转基因植株和非转基因植株的花色来鉴定。答案(1)A(2)限制性核酸内切酶(3)扩增(4)花色2.(20164月浙江选考节选)兔肝细胞中的基因E编码代谢甲醛的酶，拟利用基因工程技术将基因E转入矮牵牛中，以提高矮牵牛对甲醛的代谢能力，请回答：从兔肝细胞中提取mRNA，在_酶的作用下形成互补DNA，然后以此DNA为模板扩增得到基因E。在相关酶的作用下，将基因E与Ti质粒连接在一起，形成_，再导入用氯化钙处理的_，侵染矮牵牛叶片。解析mRNA在逆转录酶的作用下形成互补DNA。将基因E与Ti质粒连接在一起，形成重组DNA分子。重组DNA分子可导入用氯化钙处理的农杆菌细胞，再用处理的农杆菌侵染矮牵牛叶片，从而使基因E整合到矮牵牛细胞的染色体DNA上。答案逆转录重组DNA分子(重组质粒)农杆菌本题组对应选修三P1P12，基因工程1.限制性核酸内切酶和DNA连接酶为基因的分离和重组提供了必要手段，而载体能够将外源基因运送到细胞中实现基因工程的目的。2.质粒是能够自主复制的双链环状DNA分子，独立于拟核之外存在，是一种特殊的遗传物质。3.基因工程的基本操作步骤有：目的基因的获得、重组DNA的形成、重组DNA导入受体细胞、筛选含有目的基因的受体细胞和目的基因的表达五个方面，其中核心是构建重组DNA分子。4.基因治疗是向目标细胞中引入正常功能的基因，以纠正或补偿基因的缺陷，达到治疗的目的。5.利用农杆菌Ti质粒介导，可以将目的基因导入植物受体细胞中，并整合到染色体DNA中，实现稳定表达。角度1基因工程工具1.已知一双链DNA分子，用限制性核酸内切酶切割得到长度为120 kb(kb：千碱基对)片段；用限制性核酸内切酶切割得到40 kb和80 kb两个片段；同时用限制性核酸内切酶和限制性核酸内切酶切割时，得到10 kb、80 kb和30 kb 3个片段。据此分析该双链DNA分子结构及酶切位点情况为()解析根据题意，该DNA用限制性核酸内切酶切割后得1条片段，故为环状DNA，根据两酶的作用特点，可知酶切图谱为D。答案D2.如图为DNA分子在不同酶的作用下所发生的变化，图中依次表示限制性核酸内切酶、DNA聚合酶、DNA连接酶、解旋酶作用的正确顺序是()A. B.C. D.解析限制性核酸内切酶可在特定位点对DNA分子进行切割，为限制性核酸内切酶。DNA聚合酶在DNA分子复制时将脱氧核苷酸连接成脱氧核苷酸链，为DNA聚合酶。DNA连接酶可将限制性核酸内切酶切开的磷酸二酯键连接在一起，为DNA连接酶。解旋酶的作用是将DNA双链解开螺旋，为复制或转录提供模板，为解旋酶。答案C1.限制性核酸内切酶(1)识别序列的特点：呈现碱基互补对称，无论是奇数个碱基还是偶数个碱基，都可以找到一条中心轴线(如图)，中轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向对称重复排列的(如下图)，以中心线为轴，两侧碱基互补对称；以为轴，两侧碱基互补对称。(2)切割后产生末端的种类粘性末端和平末端：当限制性核酸内切酶在它识别序列的中轴线两侧将DNA的两条链分别切开时，产生的是粘性末端，而当限制性核酸内切酶在它识别序列的中轴线处切开时，产生的是平末端。2.限制性核酸内切酶与DNA连接酶的关系3.与DNA有关的酶的比较项目作用底物作用部位形成产物限制性核酸内切酶DNA分子磷酸二酯键粘性末端或平末端DNA连接酶DNA片段磷酸二酯键重组DNA分子DNA聚合酶脱氧核苷酸磷酸二酯键子代DNA解旋酶DNA分子碱基对中的氢键形成脱氧核苷酸单链DNA(水解)酶DNA分子磷酸二酯键游离的脱氧核苷酸角度2基因工程原理和技术、应用1.天然的玫瑰没有蓝色花，这是由于缺少控制蓝色色素合成的基因B，而开蓝色花的矮牵牛中存在序列已知的基因B。现用基因工程技术培育蓝玫瑰，下列操作正确的是()A.提取矮牵牛蓝色花的mRNA，经逆转录获得互补的DNA，再扩增基因BB.利用限制性核酸内切酶从开蓝色花矮牵牛的基因文库中获取基因BC.利用DNA聚合酶将基因B与质粒连接后导入玫瑰细胞D.将基因B直接导入大肠杆菌，然后感染并转入玫瑰细胞解析获取目的基因B，可先提取矮牵牛蓝色花的mRNA，经逆转录获得互补的DNA，再经PCR扩增，A正确；题干中已指明基因B序列已知，故常用化学方法人工合成和PCR技术扩增基因，而从基因文库中获取序列未知的目的基因，B错误；连接目的基因与质粒的酶是DNA连接酶，C错误；将目的基因导入植物细胞，常用农杆菌转化法，不使用大肠杆菌，D错误。答案A2.科学家将外源目的基因与大肠杆菌的质粒进行重组，并在大肠杆菌中成功表达。下图表示构建重组质粒和筛选含目的基因的大肠杆菌的过程。请据图回答问题：(1)步骤和中常用的工具酶是_和_。(2)图中质粒上有抗氨苄青霉素和抗四环素两个标记基因，经过和步骤后，有些质粒上的_基因内插入了外源目的基因，形成重组质粒，由于目的基因的分隔使得该抗性基因失活。(3)步骤是_的过程，为了促进该过程，应该用_处理大肠杆菌。(4)步骤将三角瓶内的大肠杆菌接种到含四环素的培养基C上培养，目的是筛选_，能在C中生长的大肠杆菌有_种。(5)步骤：用无菌牙签挑取C上的单个菌落，分别接种到D(含氨苄青霉素和四环素)和E(含四环素)两个培养基的相同位置上，一段时间后，菌落的生长状况如图所示。含目的基因的菌落位于_(D、E)上，请在图中相应的位置上圈出来。解析(1)形成重组DNA分子需要用到限制性核酸内切酶和DNA连接酶两种工具酶。(2)由图可知，有些质粒上的氨苄青霉素抗性基因被切开并接入了外源目的基因。(3)步骤是将重组质粒(目的基因)导入大肠杆菌(受体细胞)的过程；应用CaCl2溶液处理大肠杆菌增加大肠杆菌细胞壁的通透性，利于重组质粒进入大肠杆菌。(4)步骤的目的是筛选含四环素抗性基因的大肠杆菌，能在C中生长的大肠杆菌有2种，一种是只含有四环素抗性基因的大肠杆菌，另一种是含有四环素抗性基因和目的基因的大肠杆菌。(5)含有目的基因的大肠杆菌不抗氨苄青霉素，不能在含有氨苄青霉素的培养基中生长，因此含有目的基因的菌落存在于E上。答案(1)限制性核酸内切酶DNA连接酶(2)氨苄青霉素抗性(3)将重组质粒(目的基因)导入大肠杆菌(受体细胞)CaCl2溶液(4)含四环素抗性基因的大肠杆菌2(5)E1.受体细胞与导入方法生物种类植物细胞动物细胞微生物细胞常用方法农杆菌转化法显微注射技术感受态细胞法受体细胞体细胞受精卵细菌细胞转化过程将目的基因插入到Ti质粒的TDNA上农杆菌导入植物细胞整合到受体细胞的染色体DNA上表达将含有目的基因的表达载体提纯取卵(受精卵)显微注射受精卵发育获得具有新性状的动物Ca2处理细胞感受态细胞重组表达载体与感受态细胞混合感受态细胞吸收DNA分子2.基因工程中的几种检测方法(时间：40分钟分数：100分)1.下图表示利用植物细胞工程对棉花进行改良的过程，表示实验过程，请据图回答，下列说法正确的是()A.外源基因能够导入并大量复制的物质基础是自然界共用一套密码子B.过程能定向改变原生质体的遗传特性C.过程只能通过液体悬浮培养技术才能实现D.基因工程技术与花药离体培养技术相结合可快速获得纯合棉花植株解析外源基因能够正确表达的物质基础是自然界共用一套密码子，A错误；基因工程能定向改造生物的性状，B正确；愈伤组织培养时用固体培养基，而液体悬浮培养可以将愈伤组织分散成单细胞，C错误；花药离体培养得到单倍体幼苗后再用秋水仙素处理才能获得纯合植株，D错误。答案B2.科学家在河南华溪蟹中找到了金属硫蛋白基因，并以农杆菌的质粒为载体，采用转基因方法培育出了汞吸附能力极强的转基因烟草。下列有关该烟草培育的说法错误的是()A.需用特定的限制性核酸内切酶切割烟草的核酸B.转基因烟草与原烟草之间一般不会出现生殖隔离C.通过农杆菌转入重组质粒的植物细胞是单个烟草细胞或原生质体D.金属硫蛋白基因的两端与作为载体的质粒至少存在着一段核苷酸序列相同的片段解析在基因工程中，需要用特定的限制性核酸内切酶切割目的基因和运载体，而不切割烟草的核酸，A错误；转基因烟草和原来烟草之间一般不会出现生殖隔离，B正确；通过农杆菌导入目的基因的植物细胞是单个烟草细胞或原生质体，C正确；目的基因的两端与载体至少存在一段核苷酸序列相同的片段，便于目的基因插入，D正确。答案A3.chlL基因是蓝藻拟核DNA上控制叶绿素合成的基因。为了研究该基因对叶绿素合成的控制，需要构建缺失chlL基因的蓝藻细胞。技术路线如下图所示，对此技术描述中，正确的是()A.过程共形成2个磷酸二酯键B.过程都需要使用限制性核酸内切酶和DNA连接酶C.该项技术操作成功的标志是目的基因的表达D.红霉素抗性基因是标记基因，用于筛选含有chlL基因的受体细胞解析过程共形成4个磷酸二酯键，A错误；过程和过程需要限制性核酸内切酶切割和DNA连接酶连接，形成重组质粒，B正确；因最终得到的是无chlL基因的蓝藻，故操作成功的标志并不是目的基因的表达，C错误；插入红霉素抗性基因后chlL基因被破坏，因此不可能是筛选含有chlL基因的受体细胞，D错误。答案B4.下面是关于获得能产生人干扰素大肠杆菌的问题。请回答：(1)用限制性核酸内切酶识别人干扰素基因和质粒中一段特定的_并切割，然后用_连接形成重组DNA。该质粒是一种含抗生素抗性基因的_核酸分子。A.双链环状 B.单链环状C.双链线状 D.单链线状(2)将含人干扰素基因的重组质粒导入到大肠杆菌，经含有_的培养基筛选等过程，最终获得能产生人干扰素的大肠杆菌。解析(1)限制性核酸内切酶能够识别一段特定的核苷酸序列，并在特定的部位将DNA分子切割，DNA连接酶可以将两个DNA片段通过磷酸二酯键连接起来。质粒是含有抗生素抗性基因的双链环状核酸分子。(2)将含人干扰素基因的重组质粒导入大肠杆菌，经含有抗生素的培养基筛选等过程，最终获得能产生人干扰素的大肠杆菌。答案(1)核苷酸序列DNA连接酶A(2)抗生素5.(2017宁波模拟节选)新一代基因编辑工具由Cas9(一种限制性核酸内切酶)和向导RNA构成。该复合体能与DNA分子上的特定序列结合，并在合适位点切断DNA双链(如下图所示)。DNA被切断后，细胞会启动DNA损伤修复机制，在此基础上如果为细胞提供一个修复模板，细胞就会按照提供的模板在修复过程中引入片段插入或定点突变，从而实现基因编辑。请回答：(1)在将编码Cas9的基因导入真核细胞的转基因操作中，若控制合成Cas9的基因序列已知，可用_方法合成目的基因，再构建_导入真核细胞，该过程中需要使用的酶是_(A.限制性核酸内切酶B.DNA连接酶C.限制性核酸内切酶和DNA连接酶D.DNA聚合酶)。上述转基因操作成功的标志是_。(2)如图所示，基因编辑工具发挥作用时，向导RNA分子的序列与基因组DNA中特定碱基序列因为_所以能结合在一起，然后由Cas9催化_键断裂，从而使DNA分子断裂。(3)一般来说，在使用基因编辑工具对不同基因进行编辑时，应使用Cas9和_(填“相同”或“不同”)的向导RNA进行基因的相关编辑。解析(1)在基因工程中，当目的基因序列已知，可用化学方法合成目的基因，通过使用限制性核酸内切酶和DNA连接酶处理目的基因和载体DNA，构建出含目的基因的重组DNA分子，再导入受体细胞。转基因操作成功的标志是目的基因表达成功，即合成了Cas9。(2)向导RNA分子的序列与基因组DNA中特定碱基序列因为碱基序列互补所以能结合在一起，然后由Cas9催化磷酸二酯键断裂，从而使DNA分子断裂。(3)在使用基因编辑工具对不同基因进行编辑时，应使用Cas9和不同的向导RNA进行基因的相关编辑，因为不同的向导RNA会与不同的基因部分互补配对，实现对不同基因进行编辑的目的。答案(1)化学含目的基因的重组DNA分子C控制Cas9基因的成功表达(或合成了Cas9)(2)碱基序列互补磷酸二酯(3)不同6.在应用农杆菌侵染植物叶片获得转基因植株的常规实验步骤中，不需要的是()A.用携带目的基因的农杆菌侵染植物细胞B.用选择培养基筛选导入目的基因的细胞C.用聚乙二醇诱导转基因细胞的原生物质融合D.用适当比例的生长素和细胞分裂素诱导愈伤组织生芽解析农杆菌转化法是基因工程中常用的将目的基因导入植物细胞的方法，A正确；筛选含目的基因的受体细胞，可以在选择培养基上针对标记基因进行，B正确；在应用农杆菌侵染植物叶片获得转基因植株的过程中没有涉及原生质体融合，C错误；获得含目的基因的受体细胞后还要经过植物组织培养过程才能得到转基因植物，在植物组织培养过程中需要调整培养基中的生长素和细胞分裂素浓度配比，诱导其完成脱分化和再分化进程，D正确。答案C7.下列有关基因工程的叙述，正确的是()A.DNA连接酶只能将同一种限制性核酸内切酶切割而成的粘性末端连接起来B.目的基因导入受体细胞后，受体细胞即发生基因突变C.目的基因与质粒结合的过程发生在细胞外D.常使用的载体有大肠杆菌、噬菌体和动植物病毒等解析DNA连接酶能将碱基互补的粘性末端或者平末端连接起来，A错误；目的基因导入受体细胞后，受体细胞即发生基因重组，B错误；常使用的载体有质粒、噬菌体和动植物病毒，D错误。答案C8.下列有关基因工程的叙述，正确的是()A.质粒上的标记基因可能会在基因工程操作中被破坏B.限制性核酸内切酶能识别所有的核苷酸序列C.利用细菌质粒构建的重组质粒不能用于真核生物的基因工程D.受体细胞若能表达质粒载体上的标记基因，即表明重组质粒成功导入解析在形成重组DNA时，目的基因可以插入质粒上的标记基因，利用插入失活进行筛选；限制性核酸内切酶只能识别特定的核苷酸序列并在特定部位切割DNA分子；重组质粒可以导入真核细胞，也可导入原核细胞；质粒上的标记基因能表达，只能说明质粒成功导入了，不能说明重组后的质粒也导入成功了。答案A9.我国自主研制的复制型艾滋病疫苗，是把艾滋病病毒的核酸的几个重要片段逆转录后插入天花病毒DNA中，形成重组病毒疫苗。该疫苗具有复制能力，可以持续刺激免疫系统，使人产生较强的免疫能力。该疫苗研制过程中()A.运用了RNA病毒容易突变的能力B.运用了基因工程手段，使用质粒作为运载体C.通常需要利用动物的细胞培养技术D.该重组病毒的形成说明艾滋病病毒和天花病毒具有相同的遗传物质解析整个过程没有涉及基因突变，把艾滋病病毒的核酸的几个重要片段逆转录后插入天花病毒DNA中会导致基因发生重组，不同的生物的DNA能发生重组是由于两者的结构是相同的，都是双螺旋并且基本单位都一样，都遵循碱基互补配对原则，A、D错误；本题中的运载体是选用天花病毒，B错误；艾滋病病毒和天花病毒都是动物病毒，所以会涉及动物的细胞培养技术，C正确。答案C10.(201710月新高考联盟节选)利用现代生物技术，让已知碱基序列的人胰岛素原基因表达，获得基因产品。请回答：(1)可以用_方法获得目的基因(人胰岛素原基因)。(2)目的基因与质粒在_的作用下，形成重组质粒。重组质粒是否转移到大肠杆菌宿主细胞中，可用含有四环素的培养基进行筛选，原因是重组质粒上有_基因。(3)经过培养，目的基因在宿主细胞内大量扩增，并合成人胰岛素原。若要使目的基因在细胞外大量扩增，可用_技术扩增。(4)将该目的基因利用_(A.显微注射法B.农杆菌转化法C.细胞融合法D.氯化钙诱导法)导入牛受精卵，经胚胎体外培养获得早期胚胎，经_转移到受体的输卵管或子宫角，可获得转基因牛。解析(1)在已知碱基序列的前提下，人胰岛素原基因通常采用化学合成法获得。(2)目的基因与质粒在限制性核酸内切酶和DNA连接酶的作用下，形成重组质粒。重组质粒是否转移到大肠杆菌宿主细胞中，可用含有四环素的培养基进行筛选，原因是重组质粒上有四环素抗性基因。(3)若要使目的基因在细胞外大量扩增，可用PCR技术扩增。(4)将该目的基因利用显微注射法导入牛受精卵，经胚胎体外培养获得早期胚胎，经胚胎移植转移到受体的输卵管或子宫角，可获得转基因牛。答案(1)化学合成(2)限制性核酸内切酶、DNA连接酶四环素抗性基因(3)PCR(4)A胚胎移植11.将苏云金杆菌Bt蛋白的基因导入棉花细胞中，可获得抗棉铃虫的转基因棉，其过程如下图所示(注：农杆菌中Ti质粒上只有TDNA片段能转移到植物细胞中)。(1)过程需用同种_酶对含Bt基因的DNA和Ti质粒进行酶切。为将过程获得的含重组质粒的农杆菌筛选出来，应使用_培养基。(2)过程中将棉花细胞与农杆菌混合后共同培养，旨在让_进入棉花细胞；除尽农杆菌后，还须转接到含卡那霉素的培养基上继续培养，目的是_。(3)若过程仅获得大量的根，则应在培养基中增加_以获得芽；部分接种在无激素培养基上的芽也能长根，原因是_。(4)检验转基因棉的抗虫性状，常用方法是_。种植转基因抗虫棉能减少_的使用，以减轻环境污染。解析(1)过程需用同种限制性核酸内切酶对含Bt基因的DNA和Ti质粒进行酶切。为将过程获得的含重组质粒的农杆菌筛选出来，应使用选择培养基。(2)过程中将棉花细胞与农杆菌混合后共同培养，旨在让重组质粒中的TDNA进入棉花细胞；除尽农杆菌后，还须转接到含卡那霉素的培养基上继续培养，目的是筛选出含目的基因的受体细胞。(3)若过程仅获得大量的根，则应在培养基中增加细胞分裂素浓度以获得芽；部分接种在无激素培养基上的芽也能长根，原因是芽顶端合成的生长素向基部运输，促进根的分化。(4)检验转基因棉的抗虫性状，常用方法是投放棉铃虫，观察其生存情况。种植转基因抗虫棉能减少农药的使用，以减轻环境污染。答案(1)限制性核酸内切选择(2)TDNA筛选获得TDNA片段的植物细胞(3)细胞分裂素浓度芽顶端合成的生长素向基部运输，促进根的分化(4)投放棉铃虫农药12.(2017金丽衢十二校节选)下表中列出了几种限制性核酸内切酶识别序列及其切割位点，图1、图2中箭头表示相关限制性核酸内切酶的酶切位点。请回答下列问题：限制性核酸内切酶BamHBclSau3AHind识别序列及切割位点GGATCC CCTAGGTGATCA ACTAGTGATC CTAGAAGCTT TTCGAA图1图2(1)用图中质粒和目的基因构建重组质粒，应选用_两种限制性核酸内切酶切割，酶切后的载体和目的基因片段，通过_酶作用后获得重组质粒。(2)为了筛选出转入了重组质粒的大肠杆菌，应在筛选平板培养基中添加_。(3)若BamH酶切的DNA末端与Bcl酶切的DNA末端连接，连接部位的6个碱基对序列为_，对于该部位，这两种酶_(填“都能”“都不能”或“只有一种能”)切开。(4)若用Sau3A切割质粒，最多可能获得_种大小不同的DNA片段。(5)基因工程中，某些噬菌体经改造后可以作为载体，其DNA复制所需的原料来自于_。解析(1)在构建重组质粒时，需用限制性核酸内切酶切割质粒和目的基因，为提高重组效率使用两种限制性核酸内切酶，使质粒和目的基因两端产生不同的粘性末端，从而防止自身环化和倒接。选择Bcl和Hind两种限制性核酸内切酶切割，酶切后的载体和目的基因片段，通过DNA连接酶作用后获得重组质粒。Sau3A和BamH可以产生与Bcl相同的粘性末端，而且BamH在质粒的四环素抗性基因和氨苄青霉素抗性基因都有酶切点，使用BamH酶切后质粒将被破坏，所以上述两种酶不能用。(2)当选择Bcl和Hind两种限制性核酸内切酶切割质粒后，氨苄青霉素抗性基因被破坏，而四环素抗性基因完整可作为标记基因，为了筛选出转入了重组质粒的大肠杆菌，应在筛选平板培养基中添加四环素，这样导入质粒或重组质粒的大肠杆菌可以生长，其余不能生长。(3)用BamH酶切的DNA末端为，而Bcl酶切的DNA末端为，若将两者连接，则重新连接部位的6个碱基对序列为，若旋转180就是。而对重新连接部位用BamH酶和Bcl酶都不能识别，也不能切开。(4)仔细观察表中Sau3A与其他酶的识别序列和酶切位点，可以发现Sau3A能切开BamH和Bcl的识别序列，这样用Sau3A切图1质粒，就有3个不同切点，如图，若3个切点同时切开会出现3个片段，但Sau3A切割图1质粒时，可能一次切开1个切点，也可能一次切开2个切点，还可能一次切开3个，这样就可能出现、等7种大小不同的DNA片段。(5)噬菌体作为载体，当其导入受体细胞后，其DNA复制所需的原料来自于受体细胞。答案(1)Bcl和HindDNA连接(2)四环素(3)都不能(4)7(5)受体细胞15