（浙江选考）2019版高考生物一轮总复习 第九单元 生物技术实践 第30讲 微生物的利用学案

第30讲微生物的利用考试标准必考加试考试标准必考加试1.大肠杆菌的培养和分离2.分离以尿素为氮源的微生物考点一微生物的培养和分离1大肠杆菌(1)特性：大肠杆菌是革兰氏阴性、兼性厌氧(代谢类型)的肠道杆菌，在肠道中一般对人无害，但若进入人的泌尿系统，就会对人体产生危害。(2)用途：是基因工程技术中被广泛采用的工具。2细菌的培养和分离(1)细菌的繁殖：以分裂的方式繁殖，分裂速度很快，约20 min分裂一次。(2)培养的方法：需要将已有细菌的培养物转移到新的培养基中，一般用接种环(工具)转移带菌的培养物。(3)细菌分离的方法与特点分离方法特点划线分离法操作简单涂布分离法操作复杂，单菌落更易分开3.大肠杆菌的培养和分离实验(1)实验内容：将大肠杆菌扩大培养和划线分离，即用LB液体培养基扩大培养大肠杆菌，培养后再在LB固体平面培养基上划线进行分离，随后培养基上就会形成一个个单独的菌落。(2)实验步骤培养基灭菌倒平板接种划线分离培养观察50 mL LB液体培养基和50 mL LB固体培养基及培养皿高压蒸汽灭菌将培养基分别倒至4个灭菌后的培养皿中，水平放置，使之形成平面在装有液体培养基的三角瓶中接种大肠杆菌，培养12 h用接种环在接种有大肠杆菌的三角瓶中蘸菌液一次，在固体培养基的平板上连续划线，盖好培养皿培养皿倒置(盖在下面)，放在37 恒温培养箱中培养1224 h后，可看到划线的末端出现不连续的单个菌落(3)大肠杆菌分离的用途：单菌落的分离是消除污染杂菌的通用方法，也是用于筛选高表达量菌株的最简便方法之一。4微生物两种常用的接种方法比较比较划线分离法涂布分离法工具接种环玻璃刮刀原理通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基表面。在数次划线后培养，可以分离到由一个细菌细胞繁殖而来的肉眼可见的细胞群体，即菌落将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面，进行培养。在稀释度足够高的菌液里，聚集在一起的微生物将被分散成单个细菌细胞，从而能在培养基表面形成单个的菌落特点方法简单，但不适宜计数单菌落更易分开，但操作复杂些目的使培养基上形成由单个细菌细胞繁殖而来的子细胞群体菌落思考讨论1连线无菌技术的方法、类型及对象，并总结消毒与灭菌的区别。消毒和灭菌的区别项目条件结果常用的方法消毒较为温和的物理或化学方法仅杀死物体表面或内部一部分对人体有害的微生物(不包括芽孢和孢子)煮沸消毒法、巴氏消毒法、紫外线或化学药物消毒法灭菌强烈的理化因素杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子灼烧灭菌、干热灭菌、高压蒸汽灭菌2.观察甲、乙、丙、丁四幅图，熟悉倒平板的操作流程，请填空：(1)请用文字和箭头写出正确的倒平板操作流程：丙乙甲丁。(2)甲、乙、丙中的灭菌方法是灼烧灭菌。(3)丁中的操作需要等待平板冷却凝固才能进行。3下图中甲为划线分离法中最重要的环节，乙为操作的结果：(1)每一次划线后都要将接种环灼烧()(2)除第一次划线外，每一次划线的起点都是第一次划线的末端()提示平板划线时除第一次划线外，每一次划线的起点都是上一次划线的末端，而不是第一次划线的末端。(3)说明乙图划线结束后，培养皿要倒置(盖在下面)在37 恒温培养箱中培养的原因是什么？提示平板冷凝后倒置培养，使培养基表面的水分更好地挥发；防止皿盖上的水珠落入培养基中造成污染。4如图是采用纯化微生物培养的两种接种方法接种后培养的效果图，请思考：(1)获得图A效果和B效果的接种方法分别是什么？提示获得效果A的接种方法为涂布分离法，获得效果B的接种方法为划线分离法。(2)某同学在纯化土壤中的细菌时，发现培养基上的菌落连成了一片，最可能的原因是什么？应当怎样操作才可避免此种现象？提示最可能的原因是菌液浓度过高或划线时在划下一区域前未将接种环灼烧灭菌；采取的措施是增大稀释倍数或每次划新区域前先将接种环灼烧灭菌。1(2017杭州一模)据报道，一些企业生产的速冻食品中检出金黄色葡萄球菌超标，加上熟卤制品的大肠杆菌超标，“细菌门”事件引起公众普遍关注。金黄色葡萄球菌能分解卵黄中的卵磷脂，在含卵黄的固体培养基上形成的菌落周围会出现特有的乳白色的乳浊环。请回答下列问题：(1)某生物兴趣小组欲检测某果汁类食品中是否含有金黄色葡萄球菌以及该菌的含量。配制培养基：称取适量的牛肉膏、蛋白胨、NaCl、琼脂等，加入蒸馏水，搅拌加热至完全溶解后_，分装到锥形瓶后利用_进行灭菌，在无菌状态下加入卵黄液(100 mL 10%灭菌NaCl溶液中加一个鸡蛋黄，振荡均匀)摇匀后立即倒平板。接种：该小组采用涂布分离法检测果汁样品中的细菌含量。在涂布接种前，随机取若干灭菌后的空白平板先行培养了一段时间，这样做的目的是_；然后，将1 mL果汁样品稀释10倍，在3个平板上用涂布分离法分别接入0.1 mL稀释液。培养及结果：将培养皿_放入恒温培养箱中经适当培养，3个平板上的菌落数分别为19、18和17。据此可得出每升果汁样品中的活菌数为_个。(2)示意图A和B中_表示的是用涂布分离法接种培养后得到的结果。(3)下列有关常用涂布分离法的操作正确的是_。A在超净工作台中进行接种时应关闭紫外灯B接种前需先稀释，然后过滤除去杂菌C在每个固体培养基表面都可形成单菌落D玻璃刮刀浸泡在70%的酒精中灭菌，不用灼烧(4)菌种保存：在无菌条件下将单菌落用接种环取出，再用划线法接种在_上，在37 下培养24 h后，置于4 冰箱中保存。答案(1)调节pH高压蒸汽灭菌锅检测培养基平板灭菌是否合格倒置1.8106(2)B(3)A(4)斜面解析(1)培养基配制好后应调节酸碱度(pH)，分装到锥形瓶后利用高压蒸汽灭菌锅进行灭菌。涂布接种前，将制好的空白平板先培养一段时间，目的是检测培养基平板灭菌是否合格；接种后，培养皿需要倒置培养，防止皿盖上凝集的水滴滴落造成污染；0.1 mL稀释液(稀释10倍)含细菌数约为18个，得出每升果汁含有活菌数1.8106个。(2)图中A为划线分离得到的结果，B为涂布分离得到的结果。(3)在超净工作台进行接种操作时应关闭紫外灯，A正确；涂布分离前需稀释，但不能过滤除菌，B错误；稀释度较大的溶液涂布分离不一定出现菌落，C错误；玻璃刮刀浸泡后需要灼烧，D错误。(4)纯化的菌种保存在斜面上。2下图为“大肠杆菌的培养和分离”实验的基本流程，请回答下列问题：C.扩大培养(液体培养基)D.划线分离和培养(固体培养基)(1)A过程配制的是通用细菌培养基，称为_培养基。配制时除了加入特定的营养物质以外，还要加入一定量的氯化钠，以维持一定的_。对培养基酸碱度的调节，应该在B过程的_(填“前面”或“后面”)。(2)D过程与C过程相比，培养基中增加的物质是_，E过程所需的温度是_。(3)D过程后，一个菌体便会形成一个_，这种分离方法是_的通用方法，也是筛选特定菌株的最简便方法之一。(4)植物组织培养时，先配制MS培养基，再加入一定比例的植物激素，当生长素相对较多时，可促进_。(5)植物组织培养和微生物培养都需要无菌操作，下列不适宜用高压蒸汽灭菌的是()A接种环和镊子B三角瓶和广口瓶C发芽培养基和生根培养基D用于培养的幼茎和幼芽答案(1)LB液体渗透压前面(2)琼脂4 (3)(单)菌落消除污染杂菌(或纯化菌种)(4)生根(5)D解析(1)LB液体培养基是通用的细菌培养基，LB固体平面培养基则用于划线分离形成单菌落。氯化钠的作用是维持培养基的渗透压。调节好酸碱度后才能进行灭菌，若灭菌后再进行酸碱度调节，又会产生新的污染。(2)在液体培养基的基础上加入一定量的琼脂可形成固体培养基。菌种应置于4 C冰箱中保存。(3)通过划线分离后，一个菌体就会繁殖出一个菌落。(4)植物组织培养中生长素相对较多时，有利于生根，而细胞分裂素相对较多时，则有利于生芽。(5)高压蒸汽灭菌常用于培养基、培养器材等的灭菌，而用于培养的幼茎和幼芽则不能进行任何灭菌操作，否则会导致细胞死亡。3(2017嘉兴期末)下列是有关大肠杆菌的培养实验，请回答问题：(1)配制培养大肠杆菌的培养基时，根据“细菌喜荤，霉菌喜素”的规律，通常在培养基中加入蛋白胨和_作为营养物质，为维持一定的渗透压，常需加入一定量的_。(2)大肠杆菌培养和分离的实验中，在_中进行扩大培养，培养液经_后，在LB固体培养基上进行_，并将培养皿_放在恒温培养箱中培养，可以获得如图效果。为了检测接种、培养过程是否受杂菌污染以及_，应同时将未接种的培养基放入相同条件的恒温培养箱培养。(3)通常对获得的纯菌种可以依据_的形状、大小等特征进行初步的鉴定。(4)下列关于“大肠杆菌培养和分离”的操作中，叙述正确的是()A高压灭菌加热结束时，打开放气阀使压力表指针回到零后，开启锅盖B倒平板时，应将打开的皿盖放到一边，以免培养基溅到皿盖上C为了防止污染，接种工具经火焰灭菌后应趁热快速挑取菌落D用记号笔标记培养皿中菌落时，应标记在皿底上答案(1)酵母提取物NaCl(2)LB液体培养基稀释分离倒置无菌操作是否规范(3)菌落(4)D解析(1)配制培养大肠杆菌的培养基时，根据“细菌喜荤，霉菌喜素”的规律，通常在培养基中加入蛋白胨和酵母提取物作为营养物质，为维持一定的渗透压，常需加入一定量的NaCl。(2)大肠杆菌培养和分离的实验中，在LB液体培养基中进行扩大培养，培养液经稀释后，在LB固体培养基上进行分离，并将培养皿倒置放在恒温培养箱中培养；为了检测接种、培养过程是否受杂菌污染以及无菌操作是否规范，应同时将未接种的培养基放入恒温培养箱培养。(3)通常对获得的纯菌种可以依据菌落的形状、大小等特征进行初步的鉴定。(4)高压灭菌加热结束，等待压力表指针回到零后，才能开启锅盖，不能直接打开放气阀使压力表指针回到零，A错误；倒平板过程中不能打开培养皿的皿盖，以防止杂菌污染，B错误；接种环在火焰上灼烧后，待冷却后才可以快速挑取菌落，C错误；用记号笔标记培养皿中菌落时，应标记在皿底上，D正确。培养基的成分和类型(1)培养基成分：一般都含有水、碳源、氮源、无机盐、生长因子等，此外还要满足微生物生长对pH、特殊营养物质以及氧气的要求。(2)培养基的类型及其应用划分标准培养基种类特点用途物理性质液体培养基 不加凝固剂工业生产半固体培养基加凝固剂，如琼脂观察微生物的运动及微生物的分类、鉴定固体培养基加凝固剂，如琼脂微生物的分离、鉴定及活菌计数目的用途选择培养基培养基中加入某种化学物质，以抑制不需要的微生物的生长、促进所需要的微生物的生长特定微生物的培养、分离鉴别培养基根据微生物的代谢特点，在培养基中加入某种指示剂或化学药品不同种类的微生物的鉴别考点二分离以尿素为氮源的微生物1菌种特点含有脲酶，可以通过降解尿素作为其生长的氮源。2培养基用以尿素为唯一氮源的培养基培养，以LB全营养培养基为对照。3实验原理(1)筛选以尿素为氮源的微生物，可使用以尿素为唯一氮源的选择培养基进行培养选择。(2)细菌合成的脲酶能将尿素分解成NH3，致使pH升高，使酚红指示剂变红。4实验步骤5反应的鉴定在配制培养基时，加入指示剂酚红，培养时细菌将尿素分解并产生碱性的氨，使培养基上菌落周围出现红色的环带。思考讨论1分析下表所示培养基的配方，回答下列问题。成分含量成分含量KH2PO41.4 g葡萄糖10.0 gNa2HPO42.1 g尿素1.0 gMgSO47H2O0.2 g琼脂糖15.0 g将上述物质溶解后，用蒸馏水定容到1 000 mL(1)在该培养基的配方中，为微生物提供碳源的物质是葡萄糖，提供氮源的物质是尿素。(2)该培养基是(填“是”或“否”)具有选择作用，因为只有能分解尿素的微生物才能生长。(3)用琼脂糖代替琼脂配制固体培养基的原因是什么？提示琼脂是未被纯化的混合物，内含一定量的含氮化合物。如果用琼脂固体培养基，会为细菌提供一定量的非尿素类氮源，这样会在尿素固体培养基上产生大量以非尿素为氮源的细菌，所以用经纯化的琼脂糖做固化剂。2如图为分离以尿素为氮源的微生物的实验，思考回答下列问题：(1)实验目的是使用含有尿素的培养基分离能产生脲酶的细菌，使用酚红作为指示剂。(2)有脲酶的细菌菌落周围出现有色环带的原因是什么？提示细菌向胞外分泌脲酶，使培养基中尿素水解产生呈碱性的氨，遇培养基中的酚红指示剂产生颜色变化，形成红色环带。(3)制备尿素固体培养基的过程中采用的灭菌方法有高压蒸汽灭菌法、G6玻璃砂漏斗过滤法。(4)与全营养培养基相比，尿素培养基上只有少数菌落的原因是什么？提示土壤中能利用尿素的细菌占极少数。因为人和其他哺乳动物产生的排泄物毕竟是少量的，此外尿素还可以在高温下自然分解，因此，以尿素为氮源的菌群较少。(5)从上图所示实验过程中可判断出细菌悬液C的稀释度为104，用涂布分离法分离细菌。3判断下列叙述的正误(1)土样应从有哺乳动物排泄物的地方取()提示有哺乳动物排泄物的地方含脲酶的细菌较多。(2)取104、105的土壤稀释液各0.1 mL，分别涂布于全营养LB固体培养基、尿素固体培养基上()(3)将实验组和对照组平板倒置，37 C恒温培养2448 h()(4)在尿素固体培养基上生长的细菌都是以尿素为氮源的细菌()4海洋发生石油泄漏事件后，可用一些微生物有效分解石油，如何配制选择培养基将这类微生物选择出来？提示配制的选择培养基中，石油作为唯一的碳源，然后用这种培养基培养多种微生物，凡是能在该种培养基上生存的就是能分解石油的微生物。1(2017绍兴市鲁迅高级中学期中质检)回答下列问题：尿素是一种高浓度氮肥，且长期施用没有不良影响，但尿素只有通过土壤中某些细菌的分解作用，才能被植物吸收利用。某同学要分离出土壤中能分解尿素的细菌，并尝试进行计数，培养基配方如下：K2HPO4NaClH2O葡萄糖尿素酚红琼脂0.12 g0.12 g15 mL0.025 g2.0 g0.25 mg0.5 g(1)上述培养基配制完成后，应选择_法灭菌，根据培养基的成分推断，该同学能否分离出土壤中只分解尿素的细菌？_(填“能”或“否”)，推断理由是_。(2)分离得到分解尿素的细菌后，则应选择_培养基进行扩大培养。培养一段时间后，要借助显微镜对微生物细胞进行计数。计数过程中，下列哪种行为会影响计数的准确性_。A计数时直接从静置培养的试管底部取培养液进行计数B如果方格内微生物细胞数量多于300个，应将培养液先稀释后再计数C如果微生物细胞有粘连，要数出团块中的每一个细胞D压在方格线上的细胞只计左线和上线上的细胞数(3)为了提高尿素肥效，可以将分解尿素的酶和尿素混合，制成“加酶尿素”。为了提高“加酶尿素”中酶的利用率，可采用_技术。答案(1)高压蒸汽灭菌否琼脂是未纯化的混合物，内含一定量的含氮化合物，导致尿素不是唯一的氮源(2)液体A(3)固定化酶解析(1)高压蒸汽灭菌适合于耐高温的物品，如培养基、金属器械、玻璃等，题述培养基配制完成后，应选择高压蒸汽灭菌；该同学不能分离出土壤中只分解尿素的细菌，因为琼脂是未纯化的混合物，内含一定量的含氮化合物，导致尿素不是唯一的氮源。(2)应选择液体培养基进行扩大培养；由于重力作用，试管底部培养液中细菌种群密度较大，应将培养液摇匀后进行计数。(3)为了提高“加酶尿素”中酶的利用率，可采用固定化酶技术，使酶与尿素分开，可重复利用。2(2016浙江10月选考)请回答从土壤中分离产脲酶细菌和脲酶固定化实验的有关问题：(1)LB固体培养基：取适量的蛋白胨、酵母提取物、NaCl，加入一定量的蒸馏水溶解，再加_，灭菌备用。(2)尿素固体培养基：先将适宜浓度的尿素溶液用_灭菌过的G6玻璃砂漏斗过滤，因为G6玻璃砂漏斗_，故用于过滤除菌。然后将尿素溶液加入到已经灭菌的含有酚红的培养基中，备用。(3)取适量含产脲酶细菌的104、105两种土壤稀释液，分别涂布接种到LB固体培养基和尿素固体培养基上，培养48 h，推测固体培养基上生长的菌落数最少的是_。(A.105稀释液尿素固体培养基B105稀释液LB固体培养基C104稀释液尿素固体培养基D104稀释液LB固体培养基)。在尿素固体培养基上产脲酶细菌菌落周围出现_，其原因是细菌产生的脲酶催化尿素分解产生_所致。(4)制备固定化脲酶时，用石英砂吸附脲酶，装柱。再用蒸馏水洗涤固定化酶柱，其作用是_。答案(1)琼脂(2)高压蒸汽孔径小，细菌不能滤过(3)A红色环带氨(或NH3)(4)除去游离的脲酶解析(1)固体培养基中需添加琼脂起到凝固的作用。(2)因为G6玻璃砂漏斗中存在杂菌，所以在其过滤除菌之前需进行高压蒸汽灭菌；G6玻璃砂漏斗能过滤除菌的原理是其孔径较小，细菌不能通过。(3)土壤中的微生物在LB全营养培养基中都能生长，在尿素固体培养基中只有能利用尿素的微生物能生长，104土壤稀释液中微生物数量较多，所以推测固体培养基上生长的菌落数最少的是105尿素固体培养基；在尿素固体培养基上产脲酶的细菌菌落周围会出现红色环带，这是因为细菌产生的脲酶催化尿素分解产生了氨(NH3)，导致培养基呈碱性，培养基中的酚红遇碱性条件会变红。(4)并不是所有的脲酶都吸附在石英砂上，所以装柱后需用蒸馏水洗涤固定化酶柱，以洗去多余的未吸附的脲酶。3如图是从土壤中筛选产脲酶细菌的过程。(1)图中选择培养基应以_为唯一氮源；鉴别培养基还需添加_作为指示剂，产脲酶细菌在该培养基上生长一段时间后，其菌落周围的指示剂将变成_色。(2)在5个细菌培养基平板上，均接种稀释倍数为105的土壤样品溶液0.1 mL，培养一段时间后，平板上长出的细菌菌落数分别为13、156、462、178和191。该过程采取的接种方法是_，每克土壤样品中的细菌数量为_108个；与血细胞计数板计数法相比，此计数方法测得的细菌数较_。答案(1)尿素酚红红(2)涂布分离法1.75少解析(1)脲酶能够催化尿素分解为氨，故图中选择培养基应以尿素作为唯一氮源。由于尿素被分解成了氨，氨会使培养基的碱性增强，pH升高，使酚红指示剂变红色。(2)用于计数细菌菌落数的接种方法是涂布分离法，统计的菌落数应介于30300之间，故选择细菌菌落数为156、178和191的平板计数，每克土壤样品中的细菌数量为(156178191)/30.11051.75108个。由于两个或多个细菌连接在一起时，往往统计的是一个菌落，故用此方法测得的细菌数偏少。1培养基中观测指标的分析(1)培养基中的酚红指示剂产生颜色变化(变红)，标志着存在脲酶水解尿素的作用，从而证明这一菌株能以尿素为氮源。红色环状区域的大小代表脲酶活性的强弱和含量的多少。红色区域越大，表明菌株利用尿素的能力越强。(2)与全营养培养基上的菌落数比较，尿素培养基上只有少数菌落，这一现象表明能利用尿素的细菌在土壤菌群中只占极少部分。2微生物筛选过程中必要的两种对照培养基及其作用对照组作用现象结论未接种培养基有无杂菌污染的判断未接种的培养皿中无菌落生长未被杂菌污染接种的LB全营养培养基选择培养基筛选作用的确认LB全营养培养基上的菌落数大于选择培养基上的数目选择培养基具有筛选作用3.样品稀释的原因和标准(1)稀释原因：样品的稀释度直接影响平板上生长的菌落数。在适当的稀释度下，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。因此，恰当的稀释度是成功地统计菌落数的关键。(2)稀释标准：选用一定范围的样品稀释液进行培养，为了保证结果准确，一般选择菌落数在30300的平板计数。模拟演练1下图是微生物平板划线示意图。划线的顺序为1、2、3、4、5。下列操作方法正确的是()A操作前要将接种环放在火焰旁灭菌B划线操作须在火焰上进行C在5区域中才有可能得到所需菌落D在1、2、3、4、5区域中划线前后都要对接种环进行灭菌答案D解析操作前要将接种环放在火焰上灼烧灭菌，A项错误；划线操作须在火焰旁进行，B项错误；在5区域中最有可能得到所需菌落，C项错误；在1、2、3、4、5区域中划线前后都要对接种环进行灭菌，D项正确。2下列关于大肠杆菌的培养的叙述，不正确的是()A在大肠杆菌培养过程中，除考虑营养条件外，还要考虑pH、温度和渗透压等条件B若对大肠杆菌活菌进行计数，要想使所得估计值更接近实际值，除应严格操作、多次重复外，还应保证待测样品的稀释度合适C在微生物培养操作过程中，为防止杂菌污染，需对培养基和培养皿进行消毒D使用过的培养基及其培养物必须经过灭菌处理后才能丢弃答案C解析微生物培养条件有营养条件、pH、温度、渗透压等，A正确；为计数活菌数，要多次实验求平均值、操作要严格，还要保证样品的稀释度合适，便于检测，B正确；为防止杂菌污染，对培养基和培养皿要进行灭菌，C错误；为防止对环境的污染，用过的培养基及其培养物必须经过灭菌处理后才能丢弃，D正确。3下图是“分离以尿素为氮源的微生物”实验的基本流程，请回答下列问题：(1)该实验培养基不能含有_。A尿素 B氯化钠C葡萄糖 D琼脂(2)尿素溶液可用_使之无菌。若要检查B过程灭菌是否彻底，可以采用的方法是_。(3)图中步骤C为_。相对于划线分离法，过程D涂布分离法的优点是_。(4)如果菌落周围出现_色环带，说明该菌落能分泌脲酶。答案(1)D(2)G6玻璃砂漏斗过滤将空白培养基放在适宜温度下培养一段时间，观察有无菌落出现(3)倒平板单菌落更易分开(4)红解析(1)分离以尿素为氮源的微生物，应该以尿素为唯一氮源，所以不应有琼脂。(2)尿素用G6玻璃砂漏斗过滤除去其中的细菌等微生物。(4)若菌落能分泌脲酶，则菌落周围会出现红色环带。4(2017宁波期末测试)石油烃是环境的重要污染源。为了筛选出具有强分解石油烃能力的微生物，进行了一系列操作，请回答下列问题：(1)分解石油烃的微生物一般要从土壤中分离，获取土壤样品的取样地点最好选在_。(2)微生物实验室采用_法对培养基进行灭菌处理。A干热灭菌 B过滤灭菌C灼烧灭菌 D高压蒸汽灭菌(3)下图为获取土壤样品后的培养研究过程：为了能有效地分离出分解石油烃的微生物，过程所用培养基的成分的特点是_，从而有利于分解石油烃的微生物的生长。(4)对进行接种常采用的两种方法分别是_和_。(5)若发现在中无法区分菌落，可以将图中取出的菌液_。(6)若实验室为分离纯化优良菌种进行了如下操作，排序最合理的是_。A BC D(7)整个微生物的分离和培养的操作，一定要注意在_条件下进行。答案(1)石油污染明显处(2)D(3)以石油烃作为唯一碳源(4)划线分离法涂布分离法(5)进行(梯度)稀释(6)B(7)无菌解析(1)分解石油烃的微生物在石油污染明显处分布较多。(2)微生物实验室常用高压蒸汽灭菌法对培养基灭菌。(3)实验过程中，过程所用培养基应用石油烃作为唯一碳源，以抑制其他种类微生物的生长，从而分离出以石油烃为碳源的微生物。(4)在微生物的分离实验中，常用划线分离法或涂布分离法进行接种。(5)若发现在中无法区分菌落，可能是菌液中细菌浓度太高，可进行梯度稀释处理后再进行接种。(6)图示为用划线分离法进行接种分离。接种过程中应先在酒精灯火焰上灼烧接种环后，蘸取菌液进行接种，整个操作在酒精灯火焰旁进行，接种结束后还须在酒精灯上灼烧接种环。(7)为避免污染，整个微生物的分离和培养的操作，一定要注意在无菌条件下进行。课时训练一、选择题1下图为实验室培养和纯化大肠杆菌过程中的部分操作步骤，下列说法错误的是()A步骤操作时需要在酒精灯火焰旁进行B步骤中，待倒入的培养基冷却后盖上培养皿的皿盖C步骤中，每次划线前后都需对接种环进行灼烧处理D划线接种结束后，将图平板倒置后放入培养箱中培养答案B解析由图可知，步骤是倒平板，步骤是用接种环蘸取菌液，步骤是进行平板划线，步骤是培养。步骤操作时需要在酒精灯火焰旁进行，防止被杂菌污染，A项正确；倒完平板后应立即盖上培养皿的皿盖，冷却后将平板倒过来放置，B项错误；每次划线前后灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后接种环上残留的菌种，使下一次划线时，接种环上的菌种直接来源于上次划线的末端，从而通过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，以便得到单菌落，C项正确；划线接种结束后，将平板倒置放入培养箱中培养，有利于培养基表面的水分更好地挥发和防止皿盖上的水珠落入培养基造成污染，D项正确。2尿素是尿素分解菌的氮源，因此在配制培养基时()A葡萄糖在培养基中含量越多越好B尿素在培养基中含量越少越好C尿素分解菌有固氮能力，故培养基中的尿素为无机氮D尿素分解菌无固氮能力，故培养基中的尿素为有机氮答案D解析尿素既可以作为尿素分解菌的氮源，也可以作为其碳源，葡萄糖在培养基中并不是越多越好，葡萄糖过多会使培养基的渗透压过高，影响尿素分解菌的繁殖，A错误；添加尿素的目的是筛选尿素分解菌，其他微生物不能很好地生活在该培养基上，尿素在培养基中不是越少越好，过少就失去了选择作用，过多又会使细胞失水死亡，B错误；尿素分解菌没有固氮能力，故培养基中需要添加尿素为氮源，C错误，D正确。3(2016舟山中学期末测试)下列有关微生物培养的叙述中，不正确的是()A获得纯净培养物的关键是防止杂菌污染B单菌落的分离是消除污染的杂菌的通用方法C培养基都必须使用高压蒸汽灭菌法灭菌D倒置平板防止培养皿盖上的冷凝水滴落答案C解析微生物培养中获得纯净培养物的关键是防止杂菌污染，A项正确；通常可以采用涂布分离法或划线分离法进行单菌落的分离，以消除污染的杂菌，B项正确；培养基通常可以进行高压蒸汽灭菌，但对于培养基中有高温易分解的成分，就不能用此方法，如培养基中的尿素等物质，C项错误；划线接种结束后需要将培养皿倒置，以防止培养基蒸发冷凝成的水滴入培养基而造成污染，D项正确。4(2017钦州期末)在做土壤中分解尿素的细菌的分离与计数实验时，甲组实验用氮源只含尿素的培养基，乙组实验用氮源除尿素外还含硝酸盐的培养基，其他成分都相同，在相同条件下操作、培养与观察，则乙组实验属于()A空白对照 B标准对照C相互对照 D条件对照答案D解析乙组和甲组实验的培养条件不同，形成了条件对照。二、非选择题5幽门螺杆菌(Hp)感染是急慢性胃炎和消化性溃疡的主要致病因素。在患者体内采集样本并制成菌液后，进行分离培养。实验基本步骤如下：请回答下列问题：(1)在配制培养基时，要加入尿素和酚红指示剂，这是因为Hp含有_，它能以尿素作为氮源；若有Hp，则菌落周围会出现_色环带。(2)下列对尿素溶液进行灭菌的最适方法是_灭菌。A高压蒸汽 B紫外灯照射C70%酒精浸泡 D过滤(3)步骤X表示_。在无菌条件下操作时，先将菌液稀释，然后将菌液_到培养基平面上。菌液稀释的目的是为了获得_菌落。(4)在培养时，需将培养皿倒置并放在_中，若不倒置培养，将导致_。(5)临床上用14C呼气试验检测人体是否感染Hp，其基本原理是Hp能将14C标记的_分解为NH3和14CO2。答案(1)脲酶红(2)D(3)接种涂布单(4)恒温培养箱无法形成单菌落(5)尿素解析(1)幽门螺杆菌(Hp)含有脲酶，能以尿素为氮源，在加入尿素和酚红指示剂的培养基中培养Hp，由于尿素经脲酶的降解可产生碱性的NH3，NH3能使培养基中的酚红由红黄色变成红色，故菌落周围会出现红色环带。(2)由于尿素加热会分解，对尿素溶液进行灭菌最好用G6玻璃砂漏斗过滤。(3)微生物的分离和培养步骤：配制培养基灭菌、倒平板接种培养。为获得单菌落，接种操作前应先将菌液稀释，然后将菌液涂布到培养基平面上即可。(4)微生物培养时需将培养皿倒置并放在恒温培养箱中，若不倒置培养，则无法形成单菌落。(5)幽门螺杆菌能将14C标记的尿素分解为NH3和14CO2，故临床上常用14C呼气试验检测人体内幽门螺杆菌的存在。6(2017宁波三中期末)饲养动物常用的植物饲料中含有难溶的植酸钙等物质，很难被动物吸收利用，还影响对其他营养物质的利用。若在饲料中添加植酸酶，则能催化其水解成为可以吸收利用的磷酸盐等。以下是科研人员从作物根部土壤中分离出产植酸酶的菌株的过程示意图。请分析作答：(1)为防止杂菌污染，要对培养基和培养皿等进行_，而且须将接种后的培养皿呈_状态放置。(2)接种以前进行的一系列操作，目的是在培养皿表面形成_。根据土壤样品的稀释倍数和接种稀释液的体积，统计平板上的_就能大致推测出样品中的活菌数。(3)由于植酸钙的不溶解性，使培养基中形成白色浑浊。产植酸酶的菌株会水解植酸钙，菌落的周围将形成透明的区域，根据透明区域的有无，可初步判断该菌是否产植酸酶，实验结果显示AE五种菌株中，_是产植酸酶的最理想菌株。(4)获得目的菌以后，若要用于植酸酶的生产，还需要进行_。答案(1)(高压蒸汽)灭菌倒置(2)单个菌落菌落数(3)E(4)扩大培养解析(1)为防止杂菌污染，要对培养基和培养皿进行(高压蒸汽)灭菌处理，而且须将接种后的培养皿呈倒置状态放置，以防止污染。(2)接种以前对样品进行稀释的目的是在培养皿表面形成单个菌落；根据土壤样品的稀释倍数和接种稀释液的体积，统计平板上的菌落数就能大致推测出样品中的活菌数。(3)根据题意，菌落体积越小，透明圈越大，说明产植酸酶越多，故E是产植酸酶的最理想菌株。(4)获得目的菌后，若用于植酸酶的生产，还需要进行扩大培养。7有些细菌可分解原油，从而消除由原油泄漏造成的土壤污染。某同学欲从受原油污染的土壤中筛选出能高效降解原油的菌株。请回答问题：(1)在筛选过程中，应将土壤样品稀释液接种于以_为唯一碳源的培养基上。从功能上讲，该培养基属于_(A.固体B液体C纯化D选择)培养基。(2)纯化菌种时，为了得到单菌落，常采用的接种方法有两种，即_。(3)为了筛选出高效菌株，可比较单菌落周围透明圈的大小，透明圈越大说明该菌株的降解能力_。(4)通常情况下，在微生物培养过程中，实验室常用的灭菌方法有灼烧灭菌、_和高压蒸汽灭菌。无菌技术要求实验操作应在酒精灯_附近进行，以避免周围环境中微生物的污染。答案(1)原油D(2)划线分离法和涂布分离法(3)越强(4)干热灭菌火焰解析(1)可以将所需要的微生物从混杂的微生物群中分离出来的培养基为选择培养基。欲筛选出能降解原油的菌株，培养基中应只含有原油而无其他碳源，这样不能降解原油的细菌在此培养基上不能生存，可筛选出能分解原油的菌种。(2)分离纯化菌种时，接种的方法有划线分离法和涂布分离法，其目的都是使聚集在一起的微生物分散成单个细胞，从而能在培养基表面形成单菌落，以便于纯化菌种。(3)降解原油能力越强的菌株，在菌落周围形成的透明圈越大。(4)实验室常用的灭菌方法有灼烧灭菌(如接种环)、干热灭菌(如培养皿)和高压蒸汽灭菌(如培养基)等。无菌技术要求整个实验操作都要在酒精灯火焰附近进行，以避免周围微生物的污染。8(2016金丽衢十校联考)下表是3组生物实验培养基。请回答下列问题：组别培养基a无机盐、蔗糖、维生素和甘氨酸等有机物、水、琼脂b葡萄糖、NaCl、K2HPO4、尿素、酚红、水、琼脂糖c蛋白胨、酵母提取物、NaCl、水、琼脂(1)分离以尿素为氮源的细菌应选用培养基_。在含有脲酶的细菌菌落周围会出现_，这是由于尿素被分解产生的_使pH升高，酚红指示剂产生颜色变化，从而证明这一菌株能以尿素为氮源。变色区域越大，表明该菌株利用尿素的能力_。(2)用培养基a进行植物组织培养，则培养基中还需加入_。一般先用_(填“发芽”或“生根”)培养基进行培养，使之长出较多的丛状苗，然后将丛状苗分株培养。答案(1)b红色环带氨越强(2)植物激素(植物生长调节剂)发芽解析(1)分离以尿素为氮源的细菌应选用以尿素为唯一氮源并添加酚红指示剂的培养基。分解尿素的微生物可产生脲酶，脲酶可催化尿素分解产生氨，氨使酚红指示剂变红，从而在菌落周围形成红色环带，形成的红色环带越大，表明该菌株利用尿素的能力越强。(2)植物组织培养所需的MS培养基需加入植物激素。培养过程中一般先用发芽培养基进行培养，使之长出较多的丛状苗，然后将丛状苗分株培养，诱导生根。9有机农药苯磺隆是一种除草剂，长期使用会污染环境，研究发现苯磺隆能被土壤中某些微生物降解。分离能降解苯磺隆菌株的实验过程如下图所示。请回答下列问题：(1)微生物生长繁殖所需的主要营养物质有碳源、水、_、_四类，该实验所用的选择培养基只能以苯磺隆作为唯一碳源，其原因是_。(2)纯化菌株时，通常使用的划线工具是_。在第二次及以后划线时，总是从上一次的末端开始划线，这样做的目的是_。(3)若要检测土样中的细菌含量，应采用_法。答案(1)氮源无机盐只有能利用苯磺隆的微生物能正常生长和繁殖(2)接种环将聚集的菌体逐步减少以便获得单个菌落(3)涂布分离解析(1)微生物生长所需要的主要营养物质包括碳源、氮源、水和无机盐。使用选择培养基是因为选择培养基上只有能利用苯磺隆的微生物能正常生长和繁殖，同时又能抑制或阻止其他微生物的生长。(2)划线分离法接种时常使用接种环划线。在第二次及以后划线时，总是从上一次的末端开始划线。这样做的目的是将聚集的菌体逐步减少以便获得单个菌落。(3)涂布分离法常常用来进行微生物的分离和计数。10某研究小组研究了不同浓度的土霉素(一种抗生素)对大肠杆菌生长的影响，实验结果见图1。(1)实验结果表明，对大肠杆菌抑制作用最明显的是浓度为_(图1中数字)的土霉素。(2)该实验中，接种大肠杆菌时所使用的接种方法是_，在培养和接种大肠杆菌时要特别注意进行_操作。为更好地体现土霉素对大肠杆菌的抑制作用，实验中还应增加一组_作为空白对照。为了严格控制土霉素的剂量，对圆纸片的要求是_。为减少实验误差，每一浓度的土霉素还要制备_。(3)长期大量使用土霉素容易引起大肠杆菌产生抗药性，这一过程的实质是大肠杆菌种群的_发生了变化。(4)该研究小组运用上述实验方法研究了相同浓度的A、B、C三种不同抗生素对大肠杆菌生长的影响。请在图2中表示这一处理方案(可模仿图1加以必要的注解)。答案(1)(2)涂布分离法无菌用无菌水浸泡的圆纸片大小、质地相同多个圆纸片(3)抗药性基因频率(4)如图所示解析(1)据图1分析，号圆纸片的抑菌圈最大，说明该浓度的土霉素对大肠杆菌抑制作用最明显。(2)图中接种大肠杆菌时所使用的接种方法是涂布分离法。接种和培养大肠杆菌的关键是无菌操作。该实验要遵循对照原则，故还应该增加一组用无菌水浸泡的圆纸片作为空白对照。圆纸片的大小、质地属于无关变量，应该相同或一致。为减少实验误差，每一浓度的土霉素还要制备多个圆纸片进行重复实验。(3)长期大量使用土霉素容易引起大肠杆菌产生抗药性，这一过程的实质是大肠杆菌种群发生进化，其抗药性基因频率发生了变化。(4)该方案的自变量为相同浓度的A、B、C三种不同抗生素，注意在图中要标记清楚，具体图解见答案。20