核酸分子杂交技术PPT课件

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资源描述
核酸分子杂交技术,是在1968年由华盛顿卡内基学院(Carnegie Institute of Washington)的Roy Britten及其同事发明的。所依据的原理是,带有互补的特定核苷酸序列的单链DNA或RNA,当它们混合在一起时,其相应的同源区段将会退火形成双链的结构。 第1页/共66页第2页/共66页第3页/共66页第4页/共66页第5页/共66页第6页/共66页Southern DNA印迹杂交印迹杂交第7页/共66页Southern DNA印迹杂交印迹杂交 使在电泳凝胶中分离的使在电泳凝胶中分离的DNA片段转移并结片段转移并结合在适当的滤膜上,然后通过同标记的单链合在适当的滤膜上,然后通过同标记的单链DNA或或 RNA探针的杂交作用检测这些被转移探针的杂交作用检测这些被转移的的DNA片段,这种实验方法叫做片段,这种实验方法叫做DNA印迹杂印迹杂交技术。由于它是由英国人交技术。由于它是由英国人Edwin Mellor Southern于于1975年首先设计出来的,故又叫年首先设计出来的,故又叫Southern blot。 第8页/共66页第9页/共66页(a)(b)(c)(d)(e)基因组基因组DNADNA限制片段限制片段硝酸纤维素滤膜硝酸纤维素滤膜同探针同源杂交的基因同探针同源杂交的基因DNA片段片段X光底片光底片第10页/共66页DNA凝胶电泳凝胶电泳第11页/共66页第12页/共66页第13页/共66页第14页/共66页第15页/共66页第16页/共66页Southern DNA 印迹杂交之印迹杂交之X光显像图片光显像图片 水稻(Oryza sativa L.)的叶绿体DNA分别用核酸内切限制酶Bgl(A-C)、BamH(D-F)、EcoR(G-I)、和Hind(J-L)消化,加样在含有EtBr染料的1%的琼脂糖凝胶电泳中作电泳分离,然后同32P标记的玉米psbA探针作Southern杂交。X光底片中显现的阳性条带 ,表明含有水稻的psbA基因序列第17页/共66页利用非放射性探针检测核苷酸利用非放射性探针检测核苷酸第18页/共66页第19页/共66页Northern blot第20页/共66页这种方法与Southern blot杂交技术十分类似,第21页/共66页Northern印迹杂交印迹杂交 1、基本原理和基本过程与、基本原理和基本过程与Southern blot基本相同基本相同 2、鉴别、鉴别RNA 3、探针可用、探针可用DNA或或RNA片段片段 4、待测样品为总、待测样品为总RNA或或mRNA第22页/共66页Northern印迹与印迹与Southern 印迹的不同点印迹的不同点 1、变性:、变性:RNA电泳前加热变性、电泳时加变性剂保电泳前加热变性、电泳时加变性剂保 持持RNA处于变性状态,处于变性状态,DNA电泳前和电泳电泳前和电泳 中不变性中不变性与与SouthernSouthern印迹杂交不同之处:印迹杂交不同之处: RNARNA电泳电泳 避免单链避免单链RNARNA自身形成高级结构和自身降解自身形成高级结构和自身降解 变性凝胶电泳变性凝胶电泳(甲醛、尿素、甲酰胺等甲醛、尿素、甲酰胺等)RNase抑制环境抑制环境第23页/共66页 2、转膜:、转膜:RNA转膜前不需变性和中和处理转膜前不需变性和中和处理,Southern 印迹时,印迹时,DNA转膜前需进行碱变性及中和处理转膜前需进行碱变性及中和处理 3、靶核酸为、靶核酸为RNA第24页/共66页第25页/共66页第26页/共66页第27页/共66页第28页/共66页原位杂交原位杂交(in situ hybridization)第29页/共66页原位杂交原位杂交 1、定义:将标记的核酸探针与固定在细胞或组、定义:将标记的核酸探针与固定在细胞或组织中的核酸进行杂交,称原位杂交。根据检测物分织中的核酸进行杂交,称原位杂交。根据检测物分细胞内原位杂交和组织切片内原位杂交;根据探针细胞内原位杂交和组织切片内原位杂交;根据探针与待检核酸分:与待检核酸分:DNA/DNA、RNA/DNA、RNA/RNA 杂交杂交第30页/共66页 保持组织细胞的形态保持组织细胞的形态 对核酸无抽提,修饰与降解作用对核酸无抽提,修饰与降解作用 不改变核酸在组织细胞内的定位不改变核酸在组织细胞内的定位 不阻碍核酸与探针的杂交过程不阻碍核酸与探针的杂交过程 对杂交信号无遮蔽作用对杂交信号无遮蔽作用 理化性质稳定理化性质稳定 2、杂交过程:、杂交过程:(1)组织或细胞的固定)组织或细胞的固定 理想固定液应具备:理想固定液应具备:第31页/共66页(2)组织细胞杂交前的预处理)组织细胞杂交前的预处理 去垢剂(如去垢剂(如Triton x-100和和SDS)和蛋白酶)和蛋白酶 K去除核酸表面的蛋白质去除核酸表面的蛋白质 组织细胞内的核酸与蛋白质结合成核酸蛋白复合体组织细胞内的核酸与蛋白质结合成核酸蛋白复合体 控制消化时间,避免细胞结构破坏和核酸从载玻控制消化时间,避免细胞结构破坏和核酸从载玻 片上脱落片上脱落第32页/共66页(3)探针的选择与标记)探针的选择与标记 以获得最好杂交效果为依据选择探针以获得最好杂交效果为依据选择探针 探针的长度一般为探针的长度一般为50300bp ,有时达有时达1.5kb 放射性核素标记探针敏感性高,操作简便稳定放射性核素标记探针敏感性高,操作简便稳定 检测结果分辨率高,但信号检测时间长检测结果分辨率高,但信号检测时间长 非核素标记探针安全、稳定性好、显色快,易非核素标记探针安全、稳定性好、显色快,易 于观察于观察第33页/共66页(4)杂交)杂交 杂交液体积小:杂交液体积小:1020l cDNA和和RNA探针杂交温度约为探针杂交温度约为50 杂交时间杂交时间:DNA探针杂交为探针杂交为24h.RNA探针杂交过夜探针杂交过夜 杂交前一般将组织切片置杂交前一般将组织切片置95 515分钟使分钟使DNA变性变性 冲洗温度一般冲洗温度一般 不超过不超过50 第34页/共66页(5)杂交结果检测)杂交结果检测 所用探针为核素标记所用探针为核素标记,放射自显影检测放射自显影检测 所用探针为非核素标记所用探针为非核素标记,比色或化学发光检测比色或化学发光检测第35页/共66页第36页/共66页第37页/共66页斑点及狭缝印迹杂交斑点及狭缝印迹杂交 1、斑点印迹为圆形、斑点印迹为圆形 2、狭缝印迹为线状、狭缝印迹为线状 3、鉴别、鉴别DNA、RNA 4、简单、快速,同一张膜可检测多个样品、简单、快速,同一张膜可检测多个样品 5、特异性不高、不能鉴别核酸分子量、特异性不高、不能鉴别核酸分子量第38页/共66页第39页/共66页第40页/共66页液相杂交液相杂交 指待测核酸和探针都存在于杂交液中,碱基互补指待测核酸和探针都存在于杂交液中,碱基互补的单链核酸分子在液体中配对形成杂交分子的过程。的单链核酸分子在液体中配对形成杂交分子的过程。第41页/共66页(一)(一)RNA酶保护分析法酶保护分析法1、RNA酶保护分析法原理酶保护分析法原理 RNaseA和和RNaseT1专一水解杂交体系中的单专一水解杂交体系中的单链链RNA,不水解探针,不水解探针RNA与待测与待测RNA互补形成互补形成的双链的双链RNA,使杂交分子得到保护,称,使杂交分子得到保护,称RNA酶酶保护分析法。保护分析法。第42页/共66页2、杂交过程、杂交过程 制备待测制备待测RNA RNA探针的制备与标记:体外转录法制备和标探针的制备与标记:体外转录法制备和标 记记RNA探针探针 杂交:待测杂交:待测RNA与与RNA探针在液相中杂交探针在液相中杂交 RNaseA和和RNaseTI除去单链除去单链RNA 电泳分离电泳分离RNA 放射自显性检测杂交结果放射自显性检测杂交结果第43页/共66页(二)核酸酶(二)核酸酶S1保护分析法保护分析法 1、原理、原理 核酸酶核酸酶S1在一定条件下专一水解杂交体系中在一定条件下专一水解杂交体系中的单链的单链DNA和单链和单链RNA,不水解,不水解DNA探针与待测探针与待测RNA杂交形成的杂交体,使杂交分子得到保护,杂交形成的杂交体,使杂交分子得到保护,称核酸酶称核酸酶S1保护分析法保护分析法第44页/共66页2、杂交过程、杂交过程 制备待测制备待测RNA:总:总RNA或或mRNA均可均可 单链单链DNA探针的制备与标记探针的制备与标记 杂交:单链杂交:单链DNA探针与待测探针与待测RNA在液相中杂交在液相中杂交 核酸酶核酸酶S1除去单链除去单链DNA和单链和单链RNA 电泳分离电泳分离DNA/RNA杂交体分子杂交体分子 放射自显影检测杂交结果放射自显影检测杂交结果第45页/共66页核酸杂交的探针核酸杂交的探针 第46页/共66页(1)常用探针类型:常用探针类型: 人工合成寡核苷酸探针人工合成寡核苷酸探针 基因组基因组DNA探针探针 cDNA探针探针 RNA探针探针第47页/共66页 (2)探针标记物探针标记物 放射性标记物放射性标记物 32P 高放射性高放射性 半衰期半衰期14.3 d 35S 放射性较弱放射性较弱 半衰期半衰期87.1 d 3H 放射性弱放射性弱 半衰期半衰期12.35 a 非放射性标记物非放射性标记物 半抗原:生物素、地高率半抗原:生物素、地高率 配体:生物素是亲和素的配体配体:生物素是亲和素的配体 荧光素:异硫氰酸荧光素、罗丹明等荧光素:异硫氰酸荧光素、罗丹明等 化学发光探针:标记物与某种底物反应发光,化学发光探针:标记物与某种底物反应发光, 如生物素酰化的碱性磷酸酶如生物素酰化的碱性磷酸酶 可使发光底物发光可使发光底物发光 第48页/共66页BiotinAvidin第49页/共66页第50页/共66页(2)探针标记物探针标记物理想标记物应具备的特性:理想标记物应具备的特性: 高度灵敏性高度灵敏性 不影响碱基配对的特异性不影响碱基配对的特异性 不影响探针分子的主要理化性质不影响探针分子的主要理化性质 对酶促反应活性无影响或影响不大对酶促反应活性无影响或影响不大 检测方法具有高度灵敏性和高度特异性检测方法具有高度灵敏性和高度特异性第51页/共66页BCIP/NBT紫蓝色沉淀紫蓝色沉淀Dig抗抗Dig抗体抗体碱性磷酸酶碱性磷酸酶第52页/共66页第53页/共66页 (3)探针标记方法探针标记方法 切切口平移法口平移法(nick translation) 随机引物法随机引物法(random primer):六核苷酸残基:六核苷酸残基的引物的引物 PCR标记法标记法 末端标记法末端标记法第54页/共66页1、利用、利用DNase I在在DNA双链上造成单链切口双链上造成单链切口2、利用大肠杆菌、利用大肠杆菌DNA聚合酶聚合酶I的的53 核酸外核酸外切酶活性在切口处将旧链从切酶活性在切口处将旧链从5 末端逐步切除末端逐步切除3、在、在DNA聚合酶聚合酶I的的53 聚合酶催化下,以聚合酶催化下,以互补的互补的DNA单链为模板依次将单链为模板依次将dNTP连接到切连接到切口的口的3 末端末端-OH上,合成新的上,合成新的DNA链,同时链,同时将标记的核苷酸掺入到新的将标记的核苷酸掺入到新的DNA链中链中切口平移法(切口平移法(nick translation)第55页/共66页切口平移法切口平移法(nick translation labeling)553333355555533335555553DNA酶酶IDNA聚合酶聚合酶I +标记的标记的dNTP53变性变性探针平均长度600bp第56页/共66页第57页/共66页第58页/共66页随机引物法随机引物法 其原理是随机引物能与各种单链其原理是随机引物能与各种单链DNA模板结合,模板结合,作为合成新链的引物,在作为合成新链的引物,在DNA聚合酶的催化下,聚合酶的催化下,按按53 方向合成一新的方向合成一新的DNA链,其核苷酸序列与链,其核苷酸序列与模板模板DNA完全互补。另一单链完全互补。另一单链DNA模板同样合成模板同样合成一条新的完全互补的一条新的完全互补的DNA链。合成时,带放射性链。合成时,带放射性核素标记的核苷酸掺入到新合成的核素标记的核苷酸掺入到新合成的DNA分子中分子中第59页/共66页随机引物法所具有的优点:随机引物法所具有的优点:1、能进行双链、能进行双链DNA、单链、单链DNA或或RNA探针的标记探针的标记2、操作简单方便,避免因、操作简单方便,避免因DNaseI处理浓度掌握不处理浓度掌握不当所带来的一系列问题当所带来的一系列问题3、标记活性高,标记活性可达、标记活性高,标记活性可达108cpm/gDNA以以上上4、可直接在低熔点琼脂糖溶液中进行标记、可直接在低熔点琼脂糖溶液中进行标记第60页/共66页随机引物法随机引物法(random primed DNA labeling)53535353随机随机6-12bp单核苷酸引物单核苷酸引物变性变性一般探针长度在400-600bp之间第61页/共66页第62页/共66页末端标记法末端标记法(terminal labeling) 3末端末端 5末端末端第63页/共66页PCR标记法标记法光敏标记法光敏标记法 生物素、地高辛等生物素、地高辛等光敏基团与生物素结合光敏基团与生物素结合化学衍生结合标记法化学衍生结合标记法 转氨标记法等转氨标记法等第64页/共66页n(4)探针的纯化探针的纯化n1、乙醇沉淀法:无水乙醇可以沉淀DNA片段,可去除dNTP和蛋白质n2、凝胶过滤柱层析法:利用凝胶的分子筛作用,将大分子DNA和小分子dNTP、磷酸根离子及寡核苷酸(80bp)等物质分离,常用凝胶基质是Sephadex G-50n3、微柱离心法:其原理与上述凝胶过滤柱层析法相同,不同的是上述采用洗脱的方式纯化探针,而此法则是利用离心的方式来纯化探针第65页/共66页感谢您的观看。感谢您的观看。第66页/共66页
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